表面展示型酿酒酵母作为寨卡病毒疫苗递送载体的研究

发布时间：2020-11-20 06:40

　　 酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae,简称S.cerevisiae)是一种单细胞真核微生物,广泛用于食品工业,因而被认为是安全。随着分子遗传学和分子生物学技术的发展,它的基因组序列已经被完全测定,开发出了许多能应用于酿酒酵母中的表达载体。寨卡病毒(Zika virus,简称ZIKV)归属于黄病毒科,黄病毒属,是一种虫媒病毒,具有传播速度快、波及范围广的特点,因此研制安全有效的疫苗毫无疑问是当务之急。尽管对ZIKV的致病机制有了一定深度的研究,但是非常遗憾的是,目前没有有效的抗病毒药物或疫苗用于治疗或预防ZIKV感染。毋庸置疑,接种疫苗是预防ZIKV感染和疫情大爆发最有效的措施之一。因此研发安全有效的疫苗是重中之重。本论文以ZIKV表面具有免疫原性的Envelope(包膜)基因作为研究对象,构建表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope,并对其免疫活性进行分析,目的是建立以表面展示型酿酒酵母为基础的病毒口服疫苗递送技术平台。(1)通过常规分子生物学方法构建了表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope。以Zika/SZ01/2016基因为模板,在上游引物中设计Nhe I酶切位点,下游引物设计EcoR I酶切位点并含终止密码子(TAA),经PCR扩增得到的Envelope基因与质粒pYD1分别经Nhe I/EcoR I双酶切后进行连接,再转化至E.coli DH5α感受态细胞,将筛选的阳性克隆提取质粒DNA,命名为:pYD1-Envelope。后电转至EBY100感受态细胞,筛选的阳性酿酒酵母命名为:EBY100/pYD1-Envelope。(2)为检测Envelope蛋白在酿酒酵母的表达定位,通过Western blot对EBY100/pYD1-Envelope的上清和沉淀裂解物进行了分析,结果表明,Envelope蛋白表达在了EBY100/pYD1-Envelope细胞内。通过多克隆抗-Envelope血清对EBY100/pYD1-Envelope表面进行处理,经免疫荧光和流式细胞仪分析,结果表明EBY100/pYD1-Envelope表面有特异性的抗原蛋白存在。此外,通过BCA蛋白定量试剂盒对Envelope抗原蛋白含量进行测定,其表达量为:0.3305μg/OD_(600nm)。(3)表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的免疫活性分析。通过ELISA检测Envelope特异性血清IgG、IgM抗体效价和粪便IgA抗体水平,考察了Regimen1、Regimen2、Regimen3三种免疫方案,结果表明Regimen3为最优免疫方案。基于酿酒酵母表面展示技术,成功地构建了EBY100/pYD1-Envelope,并建立了Envelope抗原蛋白的表面分析检测平台。通过ELISA检测Envelope特异性抗体效价,建立了口服免疫的抗体应答分析平台。本论文仅以ZIKV的Envelope基因组作为一个研究支点,而酿酒酵母表面展示技术是一个通用平台,这对研发其他病毒或细菌疫苗提供了新的研究策略和方法。
【学位单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R346;R392
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 研究背景与意义
    1.2 酵母研究概况
        1.2.1 酵母的分类
        1.2.2 酿酒酵母表面展示系统及其优势
        1.2.3 基于酿酒酵母表面展示系统构建的病毒疫苗研究进展
        1.2.4 酿酒酵母作为口服疫苗递送载体的优势
    1.3 ZIKV简介
        1.3.1 ZIKV感染对人类健康的危害
        1.3.2 ZIKV结构分析
        1.3.3 ZIKV疫苗的研究进展
    1.4 研究内容与技术路线
第2章 表面展示型酿酒酵母表达载体的构建及鉴定
    2.1 引言
    2.2 实验仪器、材料
        2.2.1 仪器
        2.2.2 材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 Envelope基因DNA浓度测定
        2.3.2 Envelope基因的扩增和酶切分析
        2.3.3 pYD1质粒的提取与酶切分析
        2.3.4 质粒pYD1-Envelope的构建
        2.3.5 表面展示型酿酒酵母表达载体的构建
    2.4 结果
        2.4.1 Envelope基因的PCR扩增结果
        2.4.2 质粒pYD1的酶切分析
        2.4.3 质粒pYD1-Envelope的酶切鉴定
        2.4.4 Envelope目标基因的PCR鉴定
    2.5 讨论
第3章 表面展示型酿酒酵母中Envelope蛋白的定位鉴定及定量分析
    3.1 引言
    3.2 实验仪器、材料
        3.2.1 仪器
        3.2.2 材料
    3.3 实验方法
        3.3.1 表面展示型酿酒酵母表达载体的诱导表达及生长曲线测定
        3.3.2 表达产物的Westernblot分析
        3.3.3 免疫荧光分析
        3.3.4 流式细胞仪分析
        3.3.5 蛋白浓度测定
    3.4 结果
        3.4.1 表面展示型酿酒酵母表达载体生长曲线
        3.4.2 Westernblot分析
        3.4.3 免疫荧光分析
        3.4.4 流式细胞分析
        3.4.5 蛋白浓度的测定
    3.5 讨论
第4章 表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope免疫活性分析
    4.1 引言
    4.2 实验仪器、材料
        4.2.1 仪器
        4.2.2 材料
    4.3 实验方法
        4.3.1 免疫前准备
        4.3.2 Envelope特异性血清IgG的检测方法
        4.3.3 Envelope特异性血清IgM的检测方法
        4.3.4 Envelope特异性粪便IgA的检测方法
    4.4 结果
        4.4.1 不同免疫方案对血清IgG的影响
        4.4.2 不同免疫方案对血清IgM的影响
        4.4.3 不同免疫方案对粪便IgA的影响
    4.5 讨论
结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表论文

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本文编号：2891097