微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60三价亚单位疫苗和核酸疫苗的制备及其免疫保护性研究
发布时间：2020-12-07 07:50
微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是隶属于顶复合器门的专性肠道细胞内寄生原虫，对免疫功能正常的宿主可引起自限性腹泻，但是对免疫功能缺陷的宿主如艾滋病患者则具有潜在的生命威胁。目前，还没有有效的药物治疗隐孢子虫感染，因此，疫苗研制是防控本病感染的一个重要策略。本研究应用多个抗原表位预测软件对微小隐孢子虫CP15、P23和CP15/60三个子孢子表面抗原的多肽序列进行了T细胞表位预测及分析，从中选取了三个抗原表位富集的基因片段，利用重叠延伸PCR技术将该三个基因的全序列和三个筛选的表位富集片段序列分别进行串联，各基因片段之间以柔性氨基酸（GGGGS）的碱基序列连接，得到融合基因CP15-P23-CP15/60和CpTm，将其分别克隆到原核表达载体pET28（a+）上，构建重组表达质粒pET-CP15-23-60和pET-CpTm，并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，将纯化的重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示两个融合基因在大肠杆菌中高效表达，Western blot分析显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清及隐孢子虫鼠基因型CP...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重叠延伸PCR串联扩增三个目的基因片段Fig.2.1ConnectionofthreegenefragmentsbyoverlapextensionPCR
25为 1185 bp（图 2.2-C），CpTm 融合基因的大小为 816 bp（图 2.2-F），均与预期相符。图2.2 融合基因的PCR扩增产物电泳结果A：CP15、P23、CP15/60基因的PCR扩增；B：融合基因CP15-P23的PCR扩增；C：融合基因CP15-P23-CP15/60的PCR扩增；D：P1、P2、P3基因的PCR扩增；E：融合基因P1-2的PCR扩增；F：融合基因CpTm的PCR扩增；M：100bp DNA分子质量标准；M1：DNA标准DL2000；1：CP15基因扩增片段；2：P23基因扩增片段；3：CP15/60基因扩增片段；4：CP15-P23基因扩增片段；5：CP15-P23-CP15/60基因扩增片段；6：P1基因扩增片段；7：P2基因扩增片段；8：P3基因扩增片段；9：P1-2基因扩增片段；10：CpTm基因扩增片段Fig. 2.2 Electrophoretic result of PCR product of fusion geneA: PCR amplification of CP15, P23 and CP15/60 genes; B: PCR amplification of CP15-P23 fusion gene; C: PCRamplification of CP15-P23-CP15/60 fusion gene; D: PCR amplification of P1, P2 and P3 genes; E: PCR amplification ofP1-2 fusion gene; F; PCR amplification of CpTm fusion gene; M: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker DL2000; 1:PCR product of CP15 gene; 2: PCR product of P23 gene; 3: PCR product of CP15/60 gene; 4: PCR product of CP15-P23fusion gene; 5: PCR product of CP15-P23-CP15/60 fusion gene;6: PCR product of P1 gene; 7: PCR product of P2 gene;8: PCR product of P3 gene; 9: PCR product of P1-2 fusion gene; 10: PCR product of CpTm fusion gene2.3.3 原核表达质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的鉴定以菌液为模板，进过25个循环的PCR扩增，结果成功地重叠延伸PCR出了CP15-P23-CP15/60和 CpTm
鍯P15-P23-CP15/60基因及其主要抗原表位区的串联表达26图2.3 重组质粒PCR鉴定电泳结果M：100 bp DNA分子质量标准；M1：DNA分子量标准Ⅳ；1：重组质粒pET-CP15-23-60 的PCR产物；2：重组质粒pET-CpTm的PCR产物Fig. 2.3 Electrophoretic result of recombinant plasmids identified by PCR ampliflicationM: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker Ⅳ; 1: PCR product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60; 2: PCRproduct of recombinant plasmid pET-CpTm图2.4 重组质粒双酶切产物的电泳结果M：DNA分子量标准Ⅳ；1：pET-CP15-23-60重组质粒EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切产物；2：pET-CpTm重组质粒EcoR Ⅰ、SalⅠ双酶切产物Fig. 2.4 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidsM: DNA Marker Ⅳ; 1: product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60 digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 2: product ofrecombinant plasmid pET-CpTm digested by EcoRⅠand SalⅠ2.3.4 重组质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的诱导表达及纯化将重组质粒 pET-CP15-23-60 和 pET-CpTm 转化入表达菌 BL21（DE3），经 IPTG（终浓度为1 mmol/L）37 ℃诱导表达 6 h，表达产物经 SDS-PAGE 分析发现 pET-CP15-23-60 的 5 号菌落和pET-CpTm 的 4 号菌落重组蛋白表达量较高（图 2.5），重组表达蛋白大小分别约为 55 ku 和 43 ku；表达时相结果显示两个重组蛋白诱导表达超过 6 h 后表达量增多不明显；不同表达形式分析结果显示，两个重组蛋白均为可溶性表达（图 2.6）；表达产物经镍柱纯化后能得到较纯的重组蛋白（图2.7）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较[J]. 胡义彬,米荣升,陈兆国. 动物医学进展. 2010(12)
[2]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达[J]. 于慧珠,陈兆国,岳城,米荣升,夏延富. 中国兽医科学. 2008(08)
[3]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析[J]. 米荣升,陈兆国,岳城,于慧珠,薛方民,于咏兰,林矫矫. 中国兽医寄生虫病. 2007(03)
[4]用微小隐孢子虫子孢子表面蛋白DNA疫苗免疫小鼠的实验研究[J]. 何宏轩,张西臣,尹继刚,李建华,杨举,刘明远,宣华. 中国兽医杂志. 2003(02)
[5]微小隐孢子虫核酸疫苗的研究[J]. 何宏轩,张西臣,赵权,尹继刚,李建华,杨举. 吉林农业大学学报. 2002(03)
[6]SDS-PAGE 法测定His-tag 融合蛋白分子量产生偏差的原因[J]. 唐威华,张景六,王宗阳,洪孟民. 植物生理学报. 2000(01)
硕士论文
[1]隐孢子虫Cp2/P30双价核酸疫苗及亚单位疫苗的研究[D]. 李春雨.吉林大学 2010
本文编号：2902911
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重叠延伸PCR串联扩增三个目的基因片段Fig.2.1ConnectionofthreegenefragmentsbyoverlapextensionPCR
25为 1185 bp（图 2.2-C），CpTm 融合基因的大小为 816 bp（图 2.2-F），均与预期相符。图2.2 融合基因的PCR扩增产物电泳结果A：CP15、P23、CP15/60基因的PCR扩增；B：融合基因CP15-P23的PCR扩增；C：融合基因CP15-P23-CP15/60的PCR扩增；D：P1、P2、P3基因的PCR扩增；E：融合基因P1-2的PCR扩增；F：融合基因CpTm的PCR扩增；M：100bp DNA分子质量标准；M1：DNA标准DL2000；1：CP15基因扩增片段；2：P23基因扩增片段；3：CP15/60基因扩增片段；4：CP15-P23基因扩增片段；5：CP15-P23-CP15/60基因扩增片段；6：P1基因扩增片段；7：P2基因扩增片段；8：P3基因扩增片段；9：P1-2基因扩增片段；10：CpTm基因扩增片段Fig. 2.2 Electrophoretic result of PCR product of fusion geneA: PCR amplification of CP15, P23 and CP15/60 genes; B: PCR amplification of CP15-P23 fusion gene; C: PCRamplification of CP15-P23-CP15/60 fusion gene; D: PCR amplification of P1, P2 and P3 genes; E: PCR amplification ofP1-2 fusion gene; F; PCR amplification of CpTm fusion gene; M: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker DL2000; 1:PCR product of CP15 gene; 2: PCR product of P23 gene; 3: PCR product of CP15/60 gene; 4: PCR product of CP15-P23fusion gene; 5: PCR product of CP15-P23-CP15/60 fusion gene;6: PCR product of P1 gene; 7: PCR product of P2 gene;8: PCR product of P3 gene; 9: PCR product of P1-2 fusion gene; 10: PCR product of CpTm fusion gene2.3.3 原核表达质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的鉴定以菌液为模板，进过25个循环的PCR扩增，结果成功地重叠延伸PCR出了CP15-P23-CP15/60和 CpTm
鍯P15-P23-CP15/60基因及其主要抗原表位区的串联表达26图2.3 重组质粒PCR鉴定电泳结果M：100 bp DNA分子质量标准；M1：DNA分子量标准Ⅳ；1：重组质粒pET-CP15-23-60 的PCR产物；2：重组质粒pET-CpTm的PCR产物Fig. 2.3 Electrophoretic result of recombinant plasmids identified by PCR ampliflicationM: 100 bp DNA Ladder; M1: DNA Marker Ⅳ; 1: PCR product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60; 2: PCRproduct of recombinant plasmid pET-CpTm图2.4 重组质粒双酶切产物的电泳结果M：DNA分子量标准Ⅳ；1：pET-CP15-23-60重组质粒EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切产物；2：pET-CpTm重组质粒EcoR Ⅰ、SalⅠ双酶切产物Fig. 2.4 Double restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmidsM: DNA Marker Ⅳ; 1: product of recombinant plasmid pET-CP15-23-60 digested by EcoRⅠand XhoⅠ; 2: product ofrecombinant plasmid pET-CpTm digested by EcoRⅠand SalⅠ2.3.4 重组质粒 pET-28a-CP15-23-60 和 pET-CpTm 的诱导表达及纯化将重组质粒 pET-CP15-23-60 和 pET-CpTm 转化入表达菌 BL21（DE3），经 IPTG（终浓度为1 mmol/L）37 ℃诱导表达 6 h，表达产物经 SDS-PAGE 分析发现 pET-CP15-23-60 的 5 号菌落和pET-CpTm 的 4 号菌落重组蛋白表达量较高（图 2.5），重组表达蛋白大小分别约为 55 ku 和 43 ku；表达时相结果显示两个重组蛋白诱导表达超过 6 h 后表达量增多不明显；不同表达形式分析结果显示，两个重组蛋白均为可溶性表达（图 2.6）；表达产物经镍柱纯化后能得到较纯的重组蛋白（图2.7）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较[J]. 胡义彬,米荣升,陈兆国. 动物医学进展. 2010(12)
[2]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达[J]. 于慧珠,陈兆国,岳城,米荣升,夏延富. 中国兽医科学. 2008(08)
[3]微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因的克隆及核苷酸序列分析[J]. 米荣升,陈兆国,岳城,于慧珠,薛方民,于咏兰,林矫矫. 中国兽医寄生虫病. 2007(03)
[4]用微小隐孢子虫子孢子表面蛋白DNA疫苗免疫小鼠的实验研究[J]. 何宏轩,张西臣,尹继刚,李建华,杨举,刘明远,宣华. 中国兽医杂志. 2003(02)
[5]微小隐孢子虫核酸疫苗的研究[J]. 何宏轩,张西臣,赵权,尹继刚,李建华,杨举. 吉林农业大学学报. 2002(03)
[6]SDS-PAGE 法测定His-tag 融合蛋白分子量产生偏差的原因[J]. 唐威华,张景六,王宗阳,洪孟民. 植物生理学报. 2000(01)
硕士论文
[1]隐孢子虫Cp2/P30双价核酸疫苗及亚单位疫苗的研究[D]. 李春雨.吉林大学 2010
本文编号：2902911
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