大鼠—小鼠嵌合体异种肺器官的研究及GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪器官/组织的免疫原性的研究
发布时间：2020-12-15 18:25
第一部分大鼠-小鼠嵌合体异种肺器官的研究研究背景利用人多功能干细胞培育组织/器官是再生医学的终极目标。但是体外器官发育十分复杂,通过干细胞体外分化而获得完整的器官是非常困难的。目前已有实验室通过异种囊胚互补技术在Pdx-/-胰腺缺陷的小鼠体内生长出大鼠PSC来源的胰腺组织。研究目的通过囊胚互补技术,将大鼠iPSCs注射到TTF-1-/-小鼠的囊胚中,在小鼠体内获得互补再生的大鼠iPSCs来源的肺器官,并检测和分析大鼠iPSCs在嵌合小鼠肺组织中的嵌合情况,来证明种间肺器官再生的可行性,为最终实现在猪体内培育出人源化的肺器官奠定良好的理论和实验基础。研究方法（1）取TTF-1+/-雌性小鼠和TTF-1+/-雄性小鼠交配后第19天的小鼠胎儿,通过H&E染色来观察其肺发育的情况。（2）通过碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP）染色的方法,鉴定大鼠iPSCs的状态。同时,用 anti-C-myc,anti-Oct4,anti-SSEA-1 和 anti-Nanog 四种抗体,来检测大鼠iPSCs的潜能性。（3）通过显微操作技术,将大鼠iPSCs作为供体细胞注射到TT...
【文章来源】：南京医科大学江苏省
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１：囊胚互补再生胰脏??近互生器继道，Ｉｓｏｔａｎｉ在胸腺缺陷的小鼠??
小鼠和雄性广＂小鼠交配获得７ＴＦ－７基因敲除小鼠的囊胚，然后通过囊胚互??补技术将大鼠ｉＰＳＣｓ注射到７ＴＦ－７基因敲除小鼠的囊胚中，在嵌合体小鼠体内??生长出大鼠ｉＰＳＣｓ来源的肺器官。操作路线图如图１－２所示。??７７Ｆ－：Ｚ基因靶向ｓｇＲＮＡ??Ｉ??精子?Ｃａｓ９ｍＲＮＡ?＋?ｓｇＲＮＡ混合物??＼?／ＶＡＡ＾＂ｒＴ??ｒｒ?大鼠丨?ＰＳＣｓ??卵母细胞?合子?７ＴＦ－１基因缺陷??大鼠－小鼠嵌合体????＼??少?囊胚??Ｘ??ＰＭＳＧ，?ｈＣＧ超数排卵??图１－２：实验技术路线图??１．２．２．２培养基的配制??（１）小鼠胚胎培养基ＫＳＯＭａａ：?０．５５５０ｇ氯化钠，０．０１８６ｇ氯化钾，０．００４７６ｇ磷酸??１９??
（２）?Ｃ５７ＢＬ／６小鼠繁育：４－６周龄的Ｃ５７ＢＬ／６雌鼠和８周龄的Ｃ５７ＢＬ／６雄鼠均??购自南京医科大学动物房。４－６周龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠将用于超数排卵获得卵母细??胞，用于体外受精。??１．２．２．５?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ?和?ｓｇＲＮＡ?的构建??Ｃａｓ９ｍＲＮＡ?（货号：Ａ２９３７８）从?ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ?公司购买，ｓｇＲＮＡ?按?ＧｅｎｅＡｒｔ？??ｇＲＮＡ精准合成试剂盒（货号：Ａ２９３７７）说明书中的步骤合成。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ和??ｓｇＲＮＡ均保存于－８０°Ｃ超低温冰箱，受精卵胞质注射前将Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ和ｓｇＲＮＡ??用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水混合。??１．２．２．６小鼠胚胎的获取和移植??（１）超数排卵获取小鼠胚胎??挑选健康的４－６周龄未成年雌性Ｃ５７Ｂ１／６品系小鼠，于１６：００注射孕马血清促??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Overexpressing dominant-negative FGFR2-IIIb impedes lung branching morphogenesis in pigs[J]. Qin Chen,Bin Fang,Ying Wang,Chu Li,Xiaoxue Li,Ronggen Wang,Qiang Xiong,Lining Zhang,Yong Jin,Manling Zhang,Xiaorui Liu,Lin Li,Lisha Mou,Rongfeng Li,Haiyuan Yang,Yifan Dai. Journal of Genetics and Genomics. 2018(03)
[2]Trends of incidence rate and age at diagnosis for cervical cancer in China,from 2000 to 2014[J]. Xueting Li,Rongshou Zheng,Xuemei Li,Haibin Shan,Qi Wu,Yan Wang,Wanqing Chen. Chinese Journal of Cancer Research. 2017(06)
[3]特发性肺纤维化药物治疗的研究进展[J]. 李雅群,朱庆均,容蓉. 中南药学. 2017(05)
[4]我国肺移植的发展现状:问题与反思[J]. 王兴安,姜格宁. 浙江医学. 2016(24)
[5]重视特发性肺纤维化的并发症[J]. 孙辉,李建生,谢洋. 中国全科医学. 2015(26)
[6]尘肺防制的研究进展与展望[J]. 陈卫红. 中华劳动卫生职业病杂志. 2006(09)
本文编号：2918703
【文章来源】：南京医科大学江苏省
【文章页数】：133 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１：囊胚互补再生胰脏??近互生器继道，Ｉｓｏｔａｎｉ在胸腺缺陷的小鼠??
小鼠和雄性广＂小鼠交配获得７ＴＦ－７基因敲除小鼠的囊胚，然后通过囊胚互??补技术将大鼠ｉＰＳＣｓ注射到７ＴＦ－７基因敲除小鼠的囊胚中，在嵌合体小鼠体内??生长出大鼠ｉＰＳＣｓ来源的肺器官。操作路线图如图１－２所示。??７７Ｆ－：Ｚ基因靶向ｓｇＲＮＡ??Ｉ??精子?Ｃａｓ９ｍＲＮＡ?＋?ｓｇＲＮＡ混合物??＼?／ＶＡＡ＾＂ｒＴ??ｒｒ?大鼠丨?ＰＳＣｓ??卵母细胞?合子?７ＴＦ－１基因缺陷??大鼠－小鼠嵌合体????＼??少?囊胚??Ｘ??ＰＭＳＧ，?ｈＣＧ超数排卵??图１－２：实验技术路线图??１．２．２．２培养基的配制??（１）小鼠胚胎培养基ＫＳＯＭａａ：?０．５５５０ｇ氯化钠，０．０１８６ｇ氯化钾，０．００４７６ｇ磷酸??１９??
（２）?Ｃ５７ＢＬ／６小鼠繁育：４－６周龄的Ｃ５７ＢＬ／６雌鼠和８周龄的Ｃ５７ＢＬ／６雄鼠均??购自南京医科大学动物房。４－６周龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠将用于超数排卵获得卵母细??胞，用于体外受精。??１．２．２．５?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ?和?ｓｇＲＮＡ?的构建??Ｃａｓ９ｍＲＮＡ?（货号：Ａ２９３７８）从?ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ?公司购买，ｓｇＲＮＡ?按?ＧｅｎｅＡｒｔ？??ｇＲＮＡ精准合成试剂盒（货号：Ａ２９３７７）说明书中的步骤合成。Ｃａｓ９ｍＲＮＡ和??ｓｇＲＮＡ均保存于－８０°Ｃ超低温冰箱，受精卵胞质注射前将Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ和ｓｇＲＮＡ??用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水混合。??１．２．２．６小鼠胚胎的获取和移植??（１）超数排卵获取小鼠胚胎??挑选健康的４－６周龄未成年雌性Ｃ５７Ｂ１／６品系小鼠，于１６：００注射孕马血清促??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Overexpressing dominant-negative FGFR2-IIIb impedes lung branching morphogenesis in pigs[J]. Qin Chen,Bin Fang,Ying Wang,Chu Li,Xiaoxue Li,Ronggen Wang,Qiang Xiong,Lining Zhang,Yong Jin,Manling Zhang,Xiaorui Liu,Lin Li,Lisha Mou,Rongfeng Li,Haiyuan Yang,Yifan Dai. Journal of Genetics and Genomics. 2018(03)
[2]Trends of incidence rate and age at diagnosis for cervical cancer in China,from 2000 to 2014[J]. Xueting Li,Rongshou Zheng,Xuemei Li,Haibin Shan,Qi Wu,Yan Wang,Wanqing Chen. Chinese Journal of Cancer Research. 2017(06)
[3]特发性肺纤维化药物治疗的研究进展[J]. 李雅群,朱庆均,容蓉. 中南药学. 2017(05)
[4]我国肺移植的发展现状:问题与反思[J]. 王兴安,姜格宁. 浙江医学. 2016(24)
[5]重视特发性肺纤维化的并发症[J]. 孙辉,李建生,谢洋. 中国全科医学. 2015(26)
[6]尘肺防制的研究进展与展望[J]. 陈卫红. 中华劳动卫生职业病杂志. 2006(09)
本文编号：2918703
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