幽门螺杆菌金属蛋白酶原核表达载体的构建与重组表达及纯化

发布时间：2020-12-20 16:04

　　目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）金属蛋白酶（metalloprotease, Mtp）基因mtp与麦芽糖结合蛋白基因mbp融合表达载体,诱导Mtp重组表达并纯化表达产物,为Hp致病机制和疫苗研究奠定基础。方法应用PCR从Hp郑州分离株MEL-Hp27的DNA扩增mtp基因,经纯化回收后与克隆载体pMD19-T连接,并进行测序验证。对重组质粒pMD19-T-mtp双酶切,酶切目的片段克隆至表达载体pMAL-c2X,然后用重组质粒pMAL-mtp转化大肠埃希菌（E.coli TB1）。从大肠埃希菌重组子中提取重组质粒,进行酶切和测序鉴定。用分光光度计测定重组菌的生长曲线。用IPTG诱导mtp表达,用SDS-PAGE法分析表达产物,并用Amylose树脂预装柱纯化Mtp蛋白。结果 PCR扩增的mtp基因片段长度为621 bp,重组菌株的酶切和测序鉴定正确;重组菌生长曲线显示重组质粒的转入对受体菌的生长无显著影响;Mtp诱导表达和纯化产物的SDS-PAGE显示,Mtp表达产物为相对分子质量为66.4×10³的水溶性融合蛋白（rMtp）,... 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年11期 北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

重组质粒pMAL-mtp的酶切鉴定

将种子菌接种至LB培养基后,菌体开始生长并进入延迟期(续约2 h),菌体浓度增加较为平缓;此后进入对数生长期,菌体浓度随时间呈指数增长;该菌株在第6 h进入稳定期,菌体生长速率开始下降,并进入恒定期。再者,TB1、TB1/pMAL-c2X和TB1/pMAL-mtp菌株生长曲线基本一致,说明重组载体的转入,并未影响受体菌的正常生长(图2)。4 重组蛋白的表达诱导及纯化产物的SDS-PAGE分析

阳性克隆子在IPTG诱导下表达的融合蛋白(rMtp)的相对分子质量为66.4×103(MBP和Mtp的相对分子质量分别为42.5×103和23.9×103)的,与预期基本相符(图3)。Bandscan 5.0分析显示,在培养工程菌2 h时加入0.3 mmol/L诱导剂,诱导5 h后表达量较高(28.4%)(图4)。讨 论

【参考文献】：
期刊论文
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[2]hp0169基因在幽门螺杆菌感染GES-1细胞中的作用研究[J]. 赵慧琳,吴玉龙,徐正,丁雲飞,张艳丽,杜镇镇,张珍,李波清,季晓飞.  中国病原生物学杂志. 2018(10)
[3]细菌胞外金属蛋白酶及其致病作用的研究进展[J]. 张颖颖,严杰,葛玉梅.  中华微生物学和免疫学杂志. 2017 (02)
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本文编号：2928152