HIV-1单价抗体的构建与活性分析

发布时间：2017-04-12 02:04

  本文关键词：HIV-1单价抗体的构建与活性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中和抗体是人体内保护性免疫反应的重要组成部分,因此找到具有广谱中和活性的单克隆抗体对治疗HIV-1以及疫苗的研究有重要的意义。由于HIV病毒的高度变异性,只用一种抗体作用病毒,病毒很容易发生逃逸,因而达不到理想的治疗效果,同时使用几种中和抗体,可明显提高其中和效率。然而抗体分子量较大,可能会出现由于几种抗体同时结合病毒颗粒表面时的空间位阻影响其中和活性。文献报道,单价抗体能很好地保持抗体的抗原结合活性,但分子量较小。将多种单价抗体混合使用,有可能达到既发挥多种抗体的中和活性,又能不造成过大的空间位阻作用。文献报道的单价抗体,主要有两种:一种为完整的重链、轻链以及N端截短型的重链分子组成的包含1个Fab和1个Fc的N端截短型的单价IgG(N-terminally truncated humanIgG,IgG-tH);另一种为一条重链和1条轻链组成的半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)的重链。本文以已知的HIV-1中和抗体2G12为模型,构建了以上两种不同的单价抗体,并对其结合活性和中和活性进行了比较,希望能找到一种既能很好保持抗体活性又易于制备的单价抗体构建方案,并以此方案构建多种单价抗体,进一步对单价抗体的结合活性、中和活性及其在两种单抗联合应用中的效果进行了研究。本文首先以2G12抗体重链基因为模板,构建了表达N端截短型的IgG重链和半分子型单价抗体两种构型的单价抗体的表达载体,并转染293T细胞进行表达,之后进行了纯化。对纯化后的两种抗体进行非还原SDS-PAGE,染色结果显示,两种单价抗体均成功表达。体外结合实验证明两种单价抗体与亲本单抗在结合活性方面差异无统计学意义。体外微量中和实验表明单价抗体基本保持了亲本抗体的中和活性,且两种构建体2G12-tH和2G12-HM无明显差异,但半分子型单价抗体更易于制备纯化。以2G12-HM型抗体的重链恒定区为基础,替换不同的已知单抗的重链可变区,并进行表达,共成功得到11种HM型单价抗体。对获得的11种单价抗体在25μg/mL的浓度下用9种不同的假病毒做体外中和试验,检测其中和活性。结果发现,有两种原型IgG未检测到中和活性的抗体(DF07-2A5和DF07-2G5),其HM分子对假病毒TRO.11检测到明显的中和活性,其余的单抗原型IgG有很好中和作用的其单价抗体的中和活性也很强,而原型IgG没有中和活性的抗体其单价抗体也未检测到中和活性。其后我们又对文献报道的具有广谱中和活性的三株单抗(VRC01、NIH45-46、PG9)进行了进一步的研究。分别比较了原型IgG和单价抗体的结合活性、抗体亲和力、中和活性以及他们与未检测到或中和活性较弱的单抗联合应用时对这些抗体的相互作用。结果发现,与原型IgG相比,单价抗体的结合活性和亲和力无明显差异,但在中和活性方面,不同的抗体改造前后的中和活性变化有所不同,其中VRC01-HM抗体对9种假病毒中的5种的中和活性有2倍以上的提高,余下4种差异不大;PG9-HM和NIH45-46-HM对假病毒的中和活性有减弱、增强和无明显差异三种不同表现。但在对这三种单抗进行两两组合对不同假病毒进行的体外中和实验中,HM型单价抗体对病毒的中和活性明显强于其原型IgG组合,主要表现在HM型抗体组合的IC50值普遍低于对应的IgG组合,且观察到协同或相加作用的实验组合明显增多,在HM和IgG组分别为40.7%和22.2%。NIH45-46-HM与PG9-HM抗体的组合对9种假病毒中的6种具有协同或相加的中和作用,而IgG组合只对其中的2种观察到类似作用。在没有检测到中和活性或中和活性很弱的7种抗体与VRC-01-HM抗体和NIH-4546-HM抗体联合应用对假病毒的中和实验中,联合应用后的中和活性均明显强于抗体单独应用。综上所述,通过对IgG抗体重链恒定区进行改造,成功获得了半分子型单价抗体。与原型IgG相比,IgG-HM的结合活性及与抗原的亲和力无明显变化;在中和活性方面,在单独应用时不同的单抗对不同病毒的中和活性有所不同,但在两种单抗联合应用时,其中和活性明显强于IgG分子的组合,为单价抗体在HIV-1治疗或预防中的应用提供了可靠的实验依据。
【关键词】：人类免疫缺陷病毒 单价抗体 中和活性 结合活性
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 主要英文缩写词4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-18
• 1.1 HIV特点12-14
• 1.2 艾滋病疫苗研究进展14-15
• 1.3 中和抗体15-16
• 1.4 课题背景16-17
• 1.5 本研究的内容和意义17-18
• 第2章 HIV-1 特异性单抗 2G12单价抗体的构建及活性分析18-30
• 2.1 引言18
• 2.2 材料18-20
• 2.2.1 细胞18
• 2.2.2 假病毒18-19
• 2.2.3 试剂以及相关溶液配制19
• 2.2.4 质粒19-20
• 2.2.5 主要实验仪器20
• 2.3 方法20-26
• 2.3.1 抗体基因改造20-23
• 2.3.2 单价抗体的制备与纯化23-24
• 2.3.3 抗体分子的SDS-PAGE鉴定24
• 2.3.4 ELISA法检测抗体特异性24-25
• 2.3.5 单价抗体的中和活性分析25-26
• 2.4 实验结果26-28
• 2.4.1 抗体改造与克隆26-27
• 2.4.2 抗体的表达27
• 2.4.3 ELISA法检测抗体特异性27-28
• 2.4.4 单克隆抗体中和活性分析28
• 2.5 讨论28-29
• 2.6 本章小结29-30
• 第3章 HIV-1 单价抗体的构建与筛选30-46
• 3.1 引言30
• 3.2 材料30-31
• 3.2.1 细胞30
• 3.2.2 假病毒30
• 3.2.3 试剂30-31
• 3.2.4 抗体31
• 3.2.5 实验仪器31
• 3.3 方法31-35
• 3.3.1 半分子型单价抗体重链基因表达表达质粒的构建31-32
• 3.3.2 单价抗体的制备与纯化32
• 3.3.3 抗体分子的SDS-PAGE鉴定32
• 3.3.4 单价抗体结合活性测试32-33
• 3.3.5 单价抗体的亲和力测定33
• 3.3.6 单价抗体与其IgG原型的中和作用比较33-34
• 3.3.7 不同单抗组合中和活性分析34
• 3.3.8 筛选后的单价抗体对低效单价抗体的加强作用检测34-35
• 3.4 结果35-43
• 3.4.1 抗体表达与纯化35-36
• 3.4.2 单价抗体结合活性分析36-37
• 3.4.3 单价抗体的亲和力检测37-39
• 3.4.4 单价抗体中和活性分析39-41
• 3.4.5 单价抗体与其IgG原型的中和相互作用比较41-42
• 3.4.6 亚中和剂量的VRC01-HM和NIH45-46HM对其他单价抗体的中和活性影响42-43
• 3.5 讨论43-45
• 3.6 本章小结45-46
• 结论46-48
• 参考文献48-53
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文53-54
• 致谢54

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1 冯一帆;HIV-1单价抗体的构建与活性分析[D];北京工业大学;2015年

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