猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

发布时间：2021-02-01 10:16

　　目的建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法通过逆转录PCR（RT-PCR）技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹（Western blot）法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3... 

【文章来源】：中国人兽共患病学报. 2019,35(12)北大核心

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【部分图文】：

Ts14-3-3.3基因PCR扩增

重组质粒pCznI-Ts14-3-3.3经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,得到4 400 bp的pCznI载体片段和747 bp的Ts14-3-3.3目的基因片段(见图2)。测序结果表明重组质粒pCznI-Ts14-3-3.3构建成功。2.3 Ts14-3-3.3重组蛋白的表达、纯化和鉴定

重组质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3经11 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导12 h后,SDS-PAGE分析,在分子质量约29.31 kD处出现明显条带(见图3),其分子质量大小与预测分子量加上His标签分子量的大小相符,说明该条带为带His标签的Ts14-3-3.3目的蛋白。Ts14-3-3.3重组蛋白主要以可溶形式存在于菌体处理后的上清液中。将Ts14-3-3.3重组蛋白通过HisLinkTM亲和层析柱纯化,获得了大小约29.31 kD的单一目的蛋白条带(见图4)。用Anti-His标签抗体作为Western blot一抗,能够识别表达的Ts14-3-3.3重组蛋白条带(见图5),说明该蛋白携带有His标签,进一步确认该条带为Ts14-3-3.3目的蛋白条带。图4 Ts14-3-3.3重组蛋白的纯化

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3012617