人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

发布时间：2021-02-11 19:23

　　目的:利用昆虫杆状病毒表达系统表达早期快速反应基因5（IER5）蛋白,为后续蛋白质结晶及探索蛋白质三级结构提供线索。方法:以HeLa细胞cDNA为模板扩增出IER5基因片段,构建重组转移质粒pFastBac1-IER5;重组转移质粒经双酶切及测序鉴定后转化至感受态细胞DH10Bac,以获得重组的穿梭质粒rBacmid-IER5;将重组穿梭质粒感染Sf9细胞,待细胞出现明显病变时收集重组杆状病毒;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot以及对表达产物进行分析鉴定。结果:重组转移质粒pFastBac1-IER5经双酶切后得到与预期相同的2条条带;重组穿梭质粒rBacmid-IER5经PCR鉴定在3 300 bp左右出现一条特异性条带;间接免疫荧光结果提示IER5蛋白在Sf9细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示,表达产物的相对分子质量约为48 k,Western blot结果表明表达产物能与IER5抗体特异性结合。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了人IER5蛋白,获得了体外表达重组IER5蛋白的相对分子质量、溶解性等物理化学特性。 

【文章来源】：癌变·畸变·突变. 2020,32(01)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

IER5基因扩增片段

将经Eco RⅠ和HindⅢ酶切后的IER5片段和pFastBacTM1质粒用T4DNA链接酶连接，转化至DH5α感受态细胞。扩大培养后提取重组质粒，经Eco RⅠ和HindⅢ酶酶切，再用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳结果如图2所示，在1 000 bp和4 700 bp处有2条与预期大小一样的条带，与预期条带大小一致，表明IER5基因已经成功克隆入pFastBacTM1质粒中，成功构建了重组杆状病毒转移载体p FastBac1-IER5。2.3 PCR鉴定重组穿梭质粒rBacmid-IER5

Sf9细胞感染重组杆状病毒后，每隔12 h观察一次细胞的形态。如图4B所示，大约到72 h左右，感染重组病毒后的细胞开始出现明显变化，细胞直径慢慢增加，折光性变强，逐渐脱壁直至细胞破碎死亡。但图4A所示的未感染重组病毒的细胞无明显变化。2.5 重组IER5蛋白间接免疫荧光

【参考文献】：
期刊论文
[1]密码子优化提高海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的表达水平[J]. 张晓元,郝荣华,刘飞,袁丹丹,陈勉,凌沛学.  食品与药品. 2019(01)
[2]辐射介导下HeLa细胞中Cdc25B与IER5蛋白表达的关系[J]. 赵现哲,刘晓丹,周平坤,姜晓燕,丁库克.  癌变·畸变·突变. 2017(06)
[3]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇.  生物技术. 2012(02)
[4]利用两种真核昆虫表达系统表达可溶性甲型H1N1血凝素蛋白[J]. 王浩,马驰,崔莲仙,巴德年,何维.  中华微生物学和免疫学杂志. 2011 (04)



本文编号：3029585