应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证
发布时间：2021-02-12 10:28
目的 :利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型。方法 :根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA（single-guide RNA,sg RNA）引物序列并克隆进入p U57-T7-GDNA载体。利用T7 RNA聚合酶体外转录sg RNA和Cas9 m RNA。将体外转录的g RNA/Cas9 m RNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定。繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况。结果:顺利构建表达sg RNA载体并体外转录,成功将有活性的sg RNA和Cas9 m RNA直接注射入受精卵。基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠。选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠。PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育。结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具。
【文章来源】：南京医科大学学报(自然科学版). 2016,36(03)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
sgRNA体外转录模板示意图
sh2Vash2Vash2项目背景B6B6B6胚胎总数（枚）113115108表1显微注射受精卵Table1Zygotemicroinjectioninvitro存活数（枚）887593移植数（枚）887593移植受体（只）334妊娠数（只）234出生小崽（只）071325存活数（只）0713242000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp检测样本数1～44。B6：对照组；M：DL2000Marker；1、2、3、5、7、19、33、39、40、42：漂移样本；6、12、15、17、35、36：疑似漂移样本；√：选取做基因测序的阳性鼠。图4F0代基因敲除鼠PCR电泳结果Figure4ElectrophoreticresultsofF0knockoutmiceafterPCR编号010203053339删除区域catcatgaccggctctgccgccgacactcaccg———tggctgcacgttgccaaggtccaccccagaccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggctc———agggggagagatggtaggcgccatcagaagcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggc———acgttgccaaggtccaccccagagggggacgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccgg———ctctgaggttgggctgagccaaatccattaccgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgacc———tgggagcggatgtggctgcacgttgccaaatgcctccccatccccgagtgcagctgggtgtg———gctgcacgttgccaaggtccaccccagag大小（bp）169216196429180483表2TA克隆测序结果Table2TAcloningandgenesequencingresults判定可移码不能移码可移码可移码不能移码可移码，翻译起始上游序列同时也被部分删除连接，成功构建pU57-T7-GDNA-sgRNA载体。经测序验证序列正确无误。2．2获得F0代Vash2基因敲除小鼠sgRNA表达载体pUC57-T7-GDNA-sgRNA和Cas9表达载体经体外转录，均匀混合sgRNA和Cas9mRNA至10ng／μL和20ng／μL，通过原核注射法显微注射B6鼠
A：1号小鼠，Exon2共删除－169bp，可以导致移码突变；B：3号小鼠共删除196bp，可以导致移码突变；C：5号小鼠共删除429bp，其中Exon2codingsequence区域删除268bp，可以导致移码突变；D：39号小鼠，共删除483bp，Exon2coding区域删除200bp，可以导致移码突变。图5测序鉴定F0代鼠1、3、5、39基因型分析结果Figure5GenesequencingandanalysisofF0knockoutmice（1，3，5，39）ABCD2．4建立Vash2敲除小鼠模型将上述经鉴定过的F0鼠1（♂）、3（♂）、5（♀）、39（♀）与B6背景的野生型小鼠进行回交获得F1代。但我们主要选择了Del429bp（Exon删除268bp）的5（♀）号小鼠进行繁育。原因是5号外显子敲除片段较大，移码突变结果较可靠。同样的方法进一步验证来自同一个5号的F1代杂合子互配获得敲除Vash2基因的F2代纯合子。随机抽取F2代Vash2基因敲除小鼠进行PCR验证，结果显示Vash2基因成功敲除（图6）。代行龙，李伟，涂敏，等．应用CRISPR／Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证［J］．南京医科大学学报（自然科学版），2016，36（3）：323－329第36卷第3期2016年3月·327·
【参考文献】：
期刊论文
[1]核型VASH2促进人胚胎组织细胞的增殖研究[J]. 葛倩倩,涂敏,高文涛,苗毅. 南京医科大学学报(自然科学版). 2015(05)
本文编号：3030710
【文章来源】：南京医科大学学报(自然科学版). 2016,36(03)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
sgRNA体外转录模板示意图
sh2Vash2Vash2项目背景B6B6B6胚胎总数（枚）113115108表1显微注射受精卵Table1Zygotemicroinjectioninvitro存活数（枚）887593移植数（枚）887593移植受体（只）334妊娠数（只）234出生小崽（只）071325存活数（只）0713242000bp1000bp500bp250bp2000bp1000bp500bp250bp检测样本数1～44。B6：对照组；M：DL2000Marker；1、2、3、5、7、19、33、39、40、42：漂移样本；6、12、15、17、35、36：疑似漂移样本；√：选取做基因测序的阳性鼠。图4F0代基因敲除鼠PCR电泳结果Figure4ElectrophoreticresultsofF0knockoutmiceafterPCR编号010203053339删除区域catcatgaccggctctgccgccgacactcaccg———tggctgcacgttgccaaggtccaccccagaccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggctc———agggggagagatggtaggcgccatcagaagcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccggc———acgttgccaaggtccaccccagagggggacgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgaccgg———ctctgaggttgggctgagccaaatccattaccgcccccttgccgtgtgcccctcatcatgacc———tgggagcggatgtggctgcacgttgccaaatgcctccccatccccgagtgcagctgggtgtg———gctgcacgttgccaaggtccaccccagag大小（bp）169216196429180483表2TA克隆测序结果Table2TAcloningandgenesequencingresults判定可移码不能移码可移码可移码不能移码可移码，翻译起始上游序列同时也被部分删除连接，成功构建pU57-T7-GDNA-sgRNA载体。经测序验证序列正确无误。2．2获得F0代Vash2基因敲除小鼠sgRNA表达载体pUC57-T7-GDNA-sgRNA和Cas9表达载体经体外转录，均匀混合sgRNA和Cas9mRNA至10ng／μL和20ng／μL，通过原核注射法显微注射B6鼠
A：1号小鼠，Exon2共删除－169bp，可以导致移码突变；B：3号小鼠共删除196bp，可以导致移码突变；C：5号小鼠共删除429bp，其中Exon2codingsequence区域删除268bp，可以导致移码突变；D：39号小鼠，共删除483bp，Exon2coding区域删除200bp，可以导致移码突变。图5测序鉴定F0代鼠1、3、5、39基因型分析结果Figure5GenesequencingandanalysisofF0knockoutmice（1，3，5，39）ABCD2．4建立Vash2敲除小鼠模型将上述经鉴定过的F0鼠1（♂）、3（♂）、5（♀）、39（♀）与B6背景的野生型小鼠进行回交获得F1代。但我们主要选择了Del429bp（Exon删除268bp）的5（♀）号小鼠进行繁育。原因是5号外显子敲除片段较大，移码突变结果较可靠。同样的方法进一步验证来自同一个5号的F1代杂合子互配获得敲除Vash2基因的F2代纯合子。随机抽取F2代Vash2基因敲除小鼠进行PCR验证，结果显示Vash2基因成功敲除（图6）。代行龙，李伟，涂敏，等．应用CRISPR／Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证［J］．南京医科大学学报（自然科学版），2016，36（3）：323－329第36卷第3期2016年3月·327·
【参考文献】：
期刊论文
[1]核型VASH2促进人胚胎组织细胞的增殖研究[J]. 葛倩倩,涂敏,高文涛,苗毅. 南京医科大学学报(自然科学版). 2015(05)
本文编号：3030710
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/3030710.html
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