幽门螺杆菌ddlA基因的克隆及生物信息学分析
发布时间：2021-03-30 20:53
目的克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶A（D-alanine-D-alanine ligase A, DdlA）基因ddlA编码区,并对其进行测序和生物信息学分析。方法以MEL-Hp27菌株基因组DNA为模版,PCR扩增ddlA基因编码区;将ddlA基因与真核表达载体pcDNA3.1（+）连接,构建重组表达载体;测序获得ddlA基因序列,利用生物信息学软件对编码DdlA蛋白的理化性质、结构特点进行分析。结果 MEL-Hp27 ddlA基因的编码区长为1 044 bp,编码347个氨基酸;编码的DdlA蛋白是一种性质稳定的亲水蛋白,相对分子质量为39.61×103,属于D-ala-D-ala连接酶N端家族;DdlA蛋白无跨膜区和信号肽,具有磷酸化位点和O-糖基化位点;二级结构中α-螺旋占36.02%,无规卷曲Cc占42.36%,延伸链Ee占18.73%,β-转角Tt占2.88%。DdlA蛋白含有7个B淋巴细胞和15个CTL细胞相关抗原表位。结论成功克隆了Hp27 ddlA基因,构建了该基因的真核表达载体,表达的...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(10)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１ＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ基因ＰＣＲ产物电泳分析
ｕｃｔｓＦｉｇ．１ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ２重组质粒的鉴定用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ进行酶切，经１．０％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，得到约５０００ｂｐ和１０００ｂｐ２条片段，与预期片段大小相符，ｄｄｌＡ基因成功插入表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）。测序显示目的基因ｄｄｌＡ长度为１０４４ｂｐ，与预期大小相符（图２）。利用ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ程序，将克隆的ｄｄｌＡ基因与ＧｅｎＢａｎｋ收录的ＨｐｄｄｌＡ基因序列进行比对分析，克隆基因ｄｄｌＡ与ＨＰＦ７２、ＨＰＦ２０９、ＨＰＭＫＭ５、ＨＰＡＧ１、Ｈｐ２６６９５菌株的ｄｄｌＡ基因同源性分别为９８．２８％、９８．０８％、９７．８０％、９５．１１％和９４．９２％。１ＤＮＡ标志物（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ双酶切３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ单酶切４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ图２重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｄｏｕｂｌｅｅｎ－ｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡａｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉ
Ｌｅｕ）占比较高为１３．５％，赖氨酸（Ｌｙｓ）占１０．７％，其余氨基酸占比均＜１０％。ＤｄｌＡ蛋白带正电荷（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）和负电荷（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）的残基总数均为４４。ＤｄｌＡ蛋白不稳定指数为３５．６２，为稳定蛋白（不稳定系数＜４０时定义为稳定蛋白），脂肪族指数为１０２．８８。该蛋白的半衰期在体外哺乳动物网状细胞中为１００ｈ，在大肠埃希菌体内＞１０ｈ，在酵母菌体内＞２０ｈ。该蛋白平均亲水指数为－０．１４０，属于亲水性蛋白（图３）。图３ＤｄｌＡ蛋白亲疏水性分析Ｆｉｇ．３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤｄｌＡｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ３．２ＤｄｌＡ蛋白信号肽和跨膜区分析采用ＳｉｇｎａｌＰ４．０ｓｅｒｖｅｒ和ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２．０预测分析ＤｄｌＡ蛋白无信号肽区域（图４）和跨膜结构（图５），属于胞内蛋白。３．３ＤｄｌＡ蛋白的磷酸化位点当阈值取０．５时，预测ＤｄｌＡ蛋白有２３个潜在的磷酸化位点，其中包括１４·１２１１·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年１０月第１４卷第１０期Ｏｃｔ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１０
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌金属蛋白酶基因生物信息学分析[J]. 余飞艳,张惠娟,张荣光,王琛,王海燕,何梦雅,范清堂,段广才. 中国病原生物学杂志. 2019(01)
[2]一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析[J]. 程相朝,田文静,张梦珂,毛福超,廖成水. 中国畜牧兽医. 2018(12)
[3]结核分枝杆菌eis基因及其编码蛋白的生物信息学分析[J]. 张西燕,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(02)
[4]Role of Helicobacter pylori infection in pathogenesis of gastric carcinoma[J]. Rong-Guang Zhang,Guang-Cai Duan,Qing-Tang Fan,Shuai-Yin Chen. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology. 2016(01)
本文编号：3110136
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(10)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１ＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ基因ＰＣＲ产物电泳分析
ｕｃｔｓＦｉｇ．１ＴｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＭＥＬ－Ｈｐ２７ｄｄｌＡ２重组质粒的鉴定用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ对重组质粒ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ进行酶切，经１．０％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，得到约５０００ｂｐ和１０００ｂｐ２条片段，与预期片段大小相符，ｄｄｌＡ基因成功插入表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１（＋）。测序显示目的基因ｄｄｌＡ长度为１０４４ｂｐ，与预期大小相符（图２）。利用ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ程序，将克隆的ｄｄｌＡ基因与ＧｅｎＢａｎｋ收录的ＨｐｄｄｌＡ基因序列进行比对分析，克隆基因ｄｄｌＡ与ＨＰＦ７２、ＨＰＦ２０９、ＨＰＭＫＭ５、ＨＰＡＧ１、Ｈｐ２６６９５菌株的ｄｄｌＡ基因同源性分别为９８．２８％、９８．０８％、９７．８０％、９５．１１％和９４．９２％。１ＤＮＡ标志物（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ双酶切３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ单酶切４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ图２重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ８０００）２ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｄｏｕｂｌｅｅｎ－ｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡａｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｄｄｌＡｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉ
Ｌｅｕ）占比较高为１３．５％，赖氨酸（Ｌｙｓ）占１０．７％，其余氨基酸占比均＜１０％。ＤｄｌＡ蛋白带正电荷（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）和负电荷（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）的残基总数均为４４。ＤｄｌＡ蛋白不稳定指数为３５．６２，为稳定蛋白（不稳定系数＜４０时定义为稳定蛋白），脂肪族指数为１０２．８８。该蛋白的半衰期在体外哺乳动物网状细胞中为１００ｈ，在大肠埃希菌体内＞１０ｈ，在酵母菌体内＞２０ｈ。该蛋白平均亲水指数为－０．１４０，属于亲水性蛋白（图３）。图３ＤｄｌＡ蛋白亲疏水性分析Ｆｉｇ．３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤｄｌＡｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ３．２ＤｄｌＡ蛋白信号肽和跨膜区分析采用ＳｉｇｎａｌＰ４．０ｓｅｒｖｅｒ和ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２．０预测分析ＤｄｌＡ蛋白无信号肽区域（图４）和跨膜结构（图５），属于胞内蛋白。３．３ＤｄｌＡ蛋白的磷酸化位点当阈值取０．５时，预测ＤｄｌＡ蛋白有２３个潜在的磷酸化位点，其中包括１４·１２１１·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年１０月第１４卷第１０期Ｏｃｔ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１０
【参考文献】：
期刊论文
[1]幽门螺杆菌金属蛋白酶基因生物信息学分析[J]. 余飞艳,张惠娟,张荣光,王琛,王海燕,何梦雅,范清堂,段广才. 中国病原生物学杂志. 2019(01)
[2]一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析[J]. 程相朝,田文静,张梦珂,毛福超,廖成水. 中国畜牧兽医. 2018(12)
[3]结核分枝杆菌eis基因及其编码蛋白的生物信息学分析[J]. 张西燕,付玉荣,伊正君. 中国病原生物学杂志. 2018(02)
[4]Role of Helicobacter pylori infection in pathogenesis of gastric carcinoma[J]. Rong-Guang Zhang,Guang-Cai Duan,Qing-Tang Fan,Shuai-Yin Chen. World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology. 2016(01)
本文编号：3110136
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