孢子丝菌双相转换过程中形态学、蛋白表达图谱及DRK1基因表达水平变化的研究

发布时间：2021-06-20 19:53

　　孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的皮肤、皮下组织及附近淋巴管的慢性感染。近年,孢子丝菌病的发生率逐年攀升。孢子丝菌在温度诱导下可进行形态转换,25°C呈菌丝相生长,37°C则呈酵母相生长。孢子丝菌向酵母相进行形态转换的过程与该菌的毒力形成关系密切。目的:明确温度诱导下孢子丝菌向酵母相转化过程中形态学、蛋白质表达图谱及DRK1基因表达水平的变化情况。方法:1、将活化的孢子丝菌标准株ATCC10268于25°C SDA液基培养96H后转种于37°C BHI液基中继续振颤培养24H、36H、48H,观察不同时段菌体的光镜及电镜下形态。2、双向电泳分离菌丝相及早期酵母相孢子丝菌的总蛋白质,以PD Quest 8.0软件进行图像分析,随机选取30个酵母相上调表达的蛋白质点进行肽指纹图谱分析,Mascot Peptide Mass Fingerprint数据检索确定其功能。3、RACE PCR扩增酵母相特异表达的蛋白质组氨酸激酶DRK1的cDNA全长并进行序列测定,以Bioedit软件推导氨基酸的序列,并确定其功能区。结果:1、申克孢子丝菌于25°C SDA和37°C BHI液体培养基培养后会呈现出... 

【文章来源】：大连医科大学辽宁省

【文章页数】：70 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

申克孢子丝菌双相转换过程中（BHI液基培养36H时）的透射电镜下所见

认为孢子丝菌感染宿主后向酵母相转化时经历三种转化方式：①菌丝细胞质浓缩，由菌丝直接出芽形成分生孢子，孢子的细胞壁与菌丝细胞壁最内层相延续（图4 b、c）。皮炎瓶霉菌、鼻疽组织胞浆菌也以该方式形成酵母相分生孢子[20]。②由分生孢子出芽形成酵母相孢子。③菌丝顶端形成串状排列的分裂子细胞，由分裂子细胞进一步形成酵母细胞。以该方式向酵母相转化的还见于巴西副球菌。上述三种转化方式可能被不同的机制调控[21]。本研究于体外诱导菌丝相孢子丝菌向酵母相的转化过程亦见以上三种转化方式，且于BHI培养基中培养36H即可发生。另外Carbonell[22]还提出双相真菌的酵母细胞是由菌丝近分隔处的结构扩大膨出而形成，酵母相细胞的细胞壁是由菌丝相细胞壁的内层形成的，此种提法与Howard提出的第1种转化方式类似。孢子丝菌酵母相特征性超微结构即是细胞壁外层出现富含微原纤维的电子致密层[21]，该观点在我们的研究中也得到证实。细胞壁因参与真菌形态的形成及其与宿主的相互作而在双相真菌毒力的研究中备受关注。Toledo[18]发现申克孢子丝菌菌丝相细胞壁的多糖成分为β-葡糖酰基鞘氨醇，酵母相则为β-葡糖酰基鞘氨醇和β-半乳糖。皮炎芽生菌菌丝相向酵母相转化时细胞壁的α-（1,3）葡聚糖增多、β-（1,3）葡聚糖减少[23]，且皮炎芽生菌的毒力与α-（1

结 果1、蛋白图谱的总体观察图5显示了菌丝相及早期酵母相总蛋白二维电泳的结果。我们以PDQuest 8.0软件比较蛋白质点染色的强弱，鉴定出300个菌丝相与早期酵母相差异表达的蛋白质点。菌丝相与酵母相蛋白图谱中染色强度相同者被定义为“共有蛋白”(例如Spot Y；图 4、5)；菌丝相与酵母相蛋白图谱中染色强度不同者被定义为“差异蛋白” 。其中两相均见表达但表达水平有差异者被称为上/下调蛋白(SpotA ，B and D ；图 4、5)，而于其中一相有表达者被称为特异表达的蛋白（Spot C；图 4、5）。我们随机选择了30个酵母相特异或上调表达的蛋白质点进行一级质谱分析。由于孢子丝菌的全基因组序列尚未公布，我们便通过在整个真菌范围内进行同源搜索来对被检测的蛋白质进行鉴定及功能分析。（表1）图 5 孢子丝菌总蛋白的双向电泳图。A为25°C SDA液基培养96H的菌丝相蛋白；B为37°C BHI液基培养36 H的早期酵母相蛋白。Y点为共有蛋白，标记有红色方框的为酵母相特异表达的蛋白，其他箭头所示为酵母相上调表达的蛋白。（蛋白点的标识与图6及表1中的标识相对应）。


本文编号：3239825