应用酵母表面展示技术筛选可诱导HIV-1广谱中和抗体的膜蛋白抗原的研究

发布时间：2017-04-24 20:00

  本文关键词：应用酵母表面展示技术筛选可诱导HIV-1广谱中和抗体的膜蛋白抗原的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：HIV-1疫苗是当今人类面临最难攻克的疫苗之一。现有的疫苗抗原无法诱导出广谱的中和抗体,成为目前有效疫苗设计的一个主要障碍。HIV-1完整膜蛋白、重组蛋白以及病毒样颗粒,存在抗原表位暴露程度低、非特异表位竞争、表位暴露存在时效性等缺点,不能成为理想的疫苗候选抗原。HIV-1病毒的包膜蛋白gp41的MPER区是能够引起多种广泛中和抗体(2F5,4E10和10E8等)的重要靶点,MPER区在病毒与细胞膜融合的过程中起到重要的作用,在gp120-CD4结合后,MPER区发生了一系列构象的变化,中和抗原表位也发生了短暂的暴露,被机体免疫系统识别,从而产生广谱中和抗体应答。但是MPER区复杂且多变的构象导致我们无法获得其构象的详细信息,因此为了获得强的针对MPER区的广谱中和抗体反应,我们做了如下的设计:一、利用随机突变PCR技术,构建一个gp41-MPER突变文库,为使文库产生足够程度的突变,即让蛋白结构发生一定的改变但又不发生太大的变化,Error-Prone PCR设定条件时将采用0.2%~5%的突变率,然后将突变文库构建到酿酒酵母表达载体p CTCON2上,形成一个p CTCON2-MPER突变库。二、利用酵母表面展示系统,将突变文库电转导入酵母细胞,半乳糖诱导表达,从而将突变蛋白库展示到酵母表面。三、利用流式细胞筛选技术,筛选出与广谱中和抗体2F5、4E10结合力强的突变株,将筛选出的细胞重新放入培养基培养,按上述步骤,进行二次筛选,重复四次,经四次筛选后,认为所获得的展示酵母应与相对应的抗体结合能力最强。四、对筛选出的抗原进行序列分析确定目的抗原,提取基因组,测序,确定突变位置。五、分析筛选出的抗原诱导相应中和抗体的能力,将展示抗原的酵母突变株免疫实验动物,三次免疫,免疫后取血清,利用间接ELISA检测法,检测突变抗原蛋白的免疫原性,即豚鼠血清中4E10、2F5样抗体的滴度。本研究的意义:(1)本课题利用酵母展示技术筛选出与广谱中和抗体具有高亲和力的抗原。(2)对筛选出的抗原进行序列分析可知哪些位点能够影响抗原抗体的结合。(3)对筛选出的理想抗原可以进行结构分析,分析所获得的突变抗原在结构及抗原位点上与原始抗原有何异同,从而希望获得有利于疫苗抗原设计的大量数据信息,以指导其作为疫苗候选抗原表位。
【关键词】：HIV-1 MPER 广谱中和抗体 酵母表面展示 Error-Prone PCR 抗原筛选
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-22
• 1.1 艾滋病简介11-14
• 1.1.1 艾滋病的现状11
• 1.1.2 HIV-1 病毒概况11-12
• 1.1.3 HIV-1 病毒生活周期以及致病机制12-13
• 1.1.4 HIV-1 在细胞内的逃逸机制13-14
• 1.2 HIV-1 主要抗原表位14-16
• 1.2.1 gp12014
• 1.2.2 gp4114-16
• 1.3 HIV-1 疫苗研究进展16-17
• 1.4 豚鼠动物模型17
• 1.5 酵母表面展示技术17-19
• 1.6 流式细胞术的应用及优势19
• 1.7 立题依据及设计19-22
• 第二章 重组质粒构建以及酵母细胞表达检测22-39
• 2.1 实验材料22-28
• 2.1.1 仪器22
• 2.1.2 常用试剂22-23
• 2.1.3 载体与质粒23
• 2.1.4 溶液配制23-28
• 2.2 实验方法28-33
• 2.2.1 序列设计28-29
• 2.2.2 PCR 合成目的片段29-30
• 2.2.3 重组p-EASY克隆载体的构建30-31
• 2.2.4 重组pCTCON2载体的构建31-32
• 2.2.5 质粒电转酵母细胞以及鉴定方法32
• 2.2.6 酵母细胞表达以及检测方法32-33
• 2.3 实验结果33-38
• 2.3.1 PCR扩增目的片段结果33-34
• 2.3.2 重组p-EASY结果34-35
• 2.3.3 重组pCTCON2载体的构建结果35-36
• 2.3.4 重组pCTCON2表达载体电转酵母结果36
• 2.3.5 酵母细胞表达以及检测结果36-38
• 2.4 本章小结38-39
• 第三章 利用易错PCR构建插入序列的突变文库39-43
• 3.1 实验材料39
• 3.1.1 仪器39
• 3.1.2 常用试剂39
• 3.1.3 载体与质粒39
• 3.2 实验方法39-41
• 3.2.1 随机突变引物设计39
• 3.2.2 利用随机突变试剂盒建酵母突变文库39-41
• 3.3 实验结果41-42
• 3.3.1 利用随机突变建酵母突变文库结果41-42
• 3.4 本章小结42-43
• 第四章 用FACS分析分选与中和广谱抗体结合力强的抗原43-49
• 4.1 实验材料43
• 4.1.1 仪器43
• 4.1.2 常用试剂43
• 4.1.3 溶液配制43
• 4.2 实验方法43-45
• 4.2.1 将突变库质粒电转导入酵母细胞43-44
• 4.2.2 流式分选与中和广谱抗体结合力强的抗原44-45
• 4.2.3 分析筛选出的抗原与原始抗原位点上的异同45
• 4.3 实验结果45-48
• 4.3.1 流式细胞仪分选与 2F5/4E10抗体结合力高的酵母细胞群45-46
• 4.3.2 筛选与抗体 2F5/4E10的结合力强的单个酵母细胞46-47
• 4.3.3 分析筛选出的抗原与原始抗原位点上的异同47-48
• 4.4 本章小结48-49
• 第五章 对筛选出的抗原免疫原性的表征49-54
• 5.1 实验材料49-50
• 5.1.1 主要试剂49-50
• 5.1.2 多肽50
• 5.1.3 实验动物50
• 5.2 实验方法50-51
• 5.2.1 验证多肽免疫原表位正确性50
• 5.2.2 免疫动物策略50-51
• 5.2.3 动物采血51
• 5.2.4 ELISA检测51
• 5.3 实验结果51-53
• 5.3.1 验证多肽免疫原表位正确性结果51-52
• 5.3.2 ELISA检测免疫原免疫豚鼠血清中特异性IgG的水平52-53
• 5.4 本章小结53-54
• 第六章 结论54-56
• 6.1 讨论54
• 6.2 结论54-55
• 6.3 创新点与展望55-56
• 参考文献56-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 胡新韬;洪坤学;邵一鸣;;抗HIV广谱中和血清表位特异性研究进展[J];中国热带医学;2011年05期

  本文关键词：应用酵母表面展示技术筛选可诱导HIV-1广谱中和抗体的膜蛋白抗原的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：324833