EV71病毒诱导细胞应激颗粒形成的初步研究

发布时间：2021-09-12 16:03

　　肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）属于小RNA病毒科,肠道病毒属,肠道病毒A型的成员,是引起婴幼儿手足口病（Hand foot and mouth disease,HFMD）的一种重要病原病毒。但截至目前,EV71病毒与宿主细胞相互作用的机制仍不清楚。为了研究EV71病毒诱导应激颗粒形成的分子机制,研究首先构建了真核表达载体pDsRed2-G3BP1,随后构建了稳定表达融合蛋白RFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系（HeLaRFP-G3BP1）,并应用Western Blot和免疫荧光技术证实了G3BP1融合蛋白的正确表达。EV71病毒感染HeLaRFP-G3BP1后,超过40%感染细胞的胞质中出现了应激颗粒。此外,应用微管特异性抑制剂破坏细胞微管完整性之后,显著抑制应激颗粒的迁移聚集。研究证明了EV71病毒诱导细胞应激颗粒的初步形成并且应激颗粒的迁移聚集依赖于微管的完整性。 

【文章来源】：黑龙江八一农垦大学学报. 2019,31(05)

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

3BP1基因片段的PCR扩增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragment

鳎?肨rizol试剂提取HeLa细胞的总RNA，进行浓度测定之后，反转录出cDNA第一条链，然后再以cDNA为模板进行PCR扩增，得到片段大小为1398bp的目的条带，即为特异的G3BP1基因片段，结果如图1。2.2重组质粒pDsRed2-G3BP1的PCR鉴定将PCR扩增后目的基因与真核表达载体pDsRed2进行双酶切，回收酶切产物。利用T4连接酶将酶切产物进行连接，将G3BP1插入BamHI/HindIII位点，连接产物转化及提取质粒后得到重组质粒pDsRed2-G3BP1。用常规方法进行PCR鉴定，电泳发现在1398bp附近处有单一明亮目的条带，符合理论设计结果，结果如图2。2.3重组质粒pDsRed2-G3BP1双酶切鉴定经PCR初步鉴定后，取少量结果为阳性的质粒，加入BamHI和HindIII两种酶置于37℃水浴锅中，将重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切结果得到片段大小约为1398bp和4689bp的两条目的条带，得到结果与预期理论设计结果相符，结果如图3。取10μLpDsRed2-G3BP1质粒送至北京生物公司进行测序，将测序结果与标准序列进行比对，结果显示，研究正确克隆了G3BP1基因，获得了正确的重组质粒pDsRed2-G3BP1。2.4RFP-G3BP1融合蛋白的检测应激颗粒组分包括诸多RNA结合蛋白（RBP），如G3BP1、TIA1、HuR等[17]。研究将重组真核表达载体pDsRed2-G3BP1转染HeLa细胞，24~48h后，用鼠抗RFP单克隆抗体进行WesternBlot检测，结果显示在70KD附近出现目的条带，结果如图4，说明构建的真核载体能能够正确表达融合蛋白。M：DL5000marker；1：G3BP1基因图2重组质粒pDsRed2-G3BP1的PCR鉴定Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP1usingPCRM：DL5000marker；1：G3BP1基因图1G3BP1基因片段的PCR扩增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragmentM：DL5000marker；1：pDsRed2；2：pDsRed2

pDsRed2进行双酶切，回收酶切产物。利用T4连接酶将酶切产物进行连接，将G3BP1插入BamHI/HindIII位点，连接产物转化及提取质粒后得到重组质粒pDsRed2-G3BP1。用常规方法进行PCR鉴定，电泳发现在1398bp附近处有单一明亮目的条带，符合理论设计结果，结果如图2。2.3重组质粒pDsRed2-G3BP1双酶切鉴定经PCR初步鉴定后，取少量结果为阳性的质粒，加入BamHI和HindIII两种酶置于37℃水浴锅中，将重组质粒进行双酶切鉴定，双酶切结果得到片段大小约为1398bp和4689bp的两条目的条带，得到结果与预期理论设计结果相符，结果如图3。取10μLpDsRed2-G3BP1质粒送至北京生物公司进行测序，将测序结果与标准序列进行比对，结果显示，研究正确克隆了G3BP1基因，获得了正确的重组质粒pDsRed2-G3BP1。2.4RFP-G3BP1融合蛋白的检测应激颗粒组分包括诸多RNA结合蛋白（RBP），如G3BP1、TIA1、HuR等[17]。研究将重组真核表达载体pDsRed2-G3BP1转染HeLa细胞，24~48h后，用鼠抗RFP单克隆抗体进行WesternBlot检测，结果显示在70KD附近出现目的条带，结果如图4，说明构建的真核载体能能够正确表达融合蛋白。M：DL5000marker；1：G3BP1基因图2重组质粒pDsRed2-G3BP1的PCR鉴定Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP1usingPCRM：DL5000marker；1：G3BP1基因图1G3BP1基因片段的PCR扩增Fig.1PCRAmplificationofG3BP1genefragmentM：DL5000marker；1：pDsRed2；2：pDsRed2-G3BP1图3重组质粒pDsRed2-G3BP1的双酶切分析Fig.3DoubleenzymedigestionanalysisofrecombinantplasmidpDsRed2-G3BP11.HeLa细胞转染空载体；2.HeLa细胞转染pDsRed2-G3BP1图4检测RFP-G3BP1融合蛋白表达Fig.4DetectionofexpressionofRFP-G3BP1fusionprotein86

【参考文献】：
期刊论文
[1]核蛋白Sam68的原核表达及鉴定[J]. 张华,陈宁,丁筠,邹德华,潘子夜,李鹏飞,李丽阳,肖丽杰,曹宏伟.  黑龙江八一农垦大学学报. 2017(03)



本文编号：3394526