HIPPO信号通路在小鼠原始卵泡启动中的作用及调控机制

发布时间：2017-05-01 20:07

  本文关键词：HIPPO信号通路在小鼠原始卵泡启动中的作用及调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:阐明原始卵泡启动的分子机制对于防治女性不孕症和卵巢早衰具有重要意义。我们的前期研究表明HIPPO信号通路存在于小鼠卵巢,且与原始卵泡池大小具有时序相关性,然其具体作用及调控机制尚不清楚。本课题通过进一步探究HIPPO信号通路在原始卵泡启动过程中的表达、作用及其调控机制,为进一步了解原始卵泡启动与静息状态维持的分子机制增添新资料。方法:1.建立小鼠原始卵泡体外培养模型,利用免疫荧光、Western blot检测3 d小鼠卵巢体外培养8 d后HIPPO通路主要组分MST1、LATS2和YAP1的定位及表达变化。2.构建HIPPO信号通路主要效应分子YAP1基因慢病毒载体:(1)YAP1慢病毒过表达载体(Vector-YAP1)和阴性对照载体(Vector)。(2)YAP1慢病毒干扰载体(sh YAP1-1、sh YAP1-2、sh YAP1-3)和阴性对照载体(sh Control)。3.利用免疫荧光和Western blot鉴定筛选YAP1沉默效果最强的慢病毒载体。4.Vector-YAP1和sh YAP1慢病毒载体分别转染3 d小鼠卵巢,HE染色和Western blot观察上调/下调YAP1对小鼠原始卵泡启动、生长的影响,同步检测信号分子AKT表达变化。5.AKT特异性抑制剂MK2206-2HCl添加于原始卵泡体外培养体系中,观察AKT下调对原始卵泡启动的影响,同步检测HIPPO通路主要组分如MST1、LATS2和YAP1的表达变化。6.将YAP1高表达慢病毒载体加入MK2206-2HCl孵育的原始卵泡体外培养体系,观察YAP1上调在AKT下调对原始卵泡启动影响中的作用。结果:1.免疫荧光结果显示:HIPPO信号通路主要组分MST1、P-MST、LATS2、YAP1和P-YAP1在3 d和3 d培养8 d后小鼠卵巢中均有表达,且MST1与LATS2共表达于小鼠卵巢。在原始卵泡中,MST1表达于卵母细胞质;P-MST表达于卵母细胞质、细胞核及颗粒细胞;LATS2表达于卵母细胞质、细胞核;YAP1和P-YAP1均表达于卵母细胞质。在初级卵泡中,MST1表达于卵母细胞质和颗粒细胞;P-MST表达于卵母细胞质、细胞核及颗粒细胞;LATS2表达于卵母细胞质和颗粒细胞;YAP1和P-YAP1均表达于卵母细胞质、细胞核及颗粒细胞。Western blot结果显示:3 d小鼠卵巢培养8 d后,MST1、P-MST、LATS2蛋白表达均显著减少(p0.05,p0.01,p0.001);YAP1、P-YAP1蛋白表达显著增加(p0.01,p0.01);P-MST/MST1、P-YAP1/YAP1比值显著减少(p0.05,p0.05)。表明,随着小鼠原始卵泡启动HIPPO通路主要组分MST1、LATS2和YAP1表达量发生显著变化,暗示原始卵泡启动与HIPPO通路活性衰减密切相关。2.构建HIPPO信号通路主要效应分子YAP1基因慢病毒载体。Western blot和免疫荧光检测结果显示:YAP1慢病毒过表达载体、干扰载体和阴性对照载体均可有效转染小鼠卵巢组织。3.筛选YAP1抑制效果最强的慢病毒载体:相对于Vector组,Vector-YAP1组YAP1蛋白表达水平显著增加(p0.05);相对于sh Control组,sh YAP1-1、sh YAP1-2、sh YAP1-3组YAP1蛋白表达水平显著减少(p0.05,p0.01,p0.001),且以sh YAP1-3组抑制效果最为显著,故选择sh YAP1-3组为最佳YAP1干扰组,记为sh YAP1组。4.Vector-YAP1和sh YAP1慢病毒载体分别转染3 d小鼠卵巢。HE染色结果显示:相较于Vector组,Vector-YAP1组原始卵泡数显著减少(p0.05),初级卵泡数显著增加(p0.05);相较于sh Control组,sh YAP1组原始卵泡数增加(p0.05),初级卵泡数显著减少(p0.05)。表明,HIPPO通路主要效应分子YAP1活性变化可显著影响原始卵泡启动过程。5.Western blot结果显示:YAP1过表达或抑制对AKT磷酸化水平无显著影响(p0.05)。AKT特异性抑制剂MK2206-2HCl添加于原始卵泡体外培养体系,相较于Control组,MK2206组AKT、MST1和YAP1总蛋白表达水平无显著变化(p0.05),而P-AKT/AKT和P-MST/MST1比值显著减少(p0.05,p0.01),P-YAP1/YAP1比值显著增加(p0.05)。表明,HIPPO通路位于AKT调控通路下游。6.HE结果显示:相较于Control组,MK2206组原始卵泡数显著增加(p0.01),初级卵泡数显著减少(p0.05)。在MK2206+Vector-YAP1组(将YAP1高表达慢病毒载体加入MK2206组)中,原始卵泡数目显著高于Control组(p0.05),但少于MK2206组(p0.05);初级卵泡数目显著低于Control组(p0.05),但高于MK2206组(p0.05)。表明,AKT下调可抑制原始卵泡启动,通过上调YAP可部分反转其抑制作用。结论:1.HIPPO通路是调控小鼠原始卵泡静息/启动的重要信号通路。2.HIPPO通路参与AKT信号分子调控原始卵泡启动。
【关键词】：HIPPO YAP1 AKT 小鼠 原始卵泡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩略词表12-13
• 第1章 引言13-16
• 第2章 材料与方法16-25
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 实验动物16
• 2.1.2 主要试剂16-18
• 2.1.3 主要仪器18-19
• 2.2 方法19-25
• 2.2.1 原始卵泡的体外培养19
• 2.2.2 石蜡切片制作19
• 2.2.3 HE染色19-20
• 2.2.4 免疫荧光20
• 2.2.5 Western blot20-21
• 2.2.6 慢病毒转染21-24
• 2.2.7 AKT特异性抑制剂MK2206孵育卵巢组织24
• 2.2.8 统计分析24-25
• 第3章 结果25-35
• 3.1 HIPPO信号通路中主要分子MST1，P-MST，，LATS2，YAP1和P-YAP1在小鼠原始卵泡启动前后表达及分布变化25-29
• 3.2 YAP1慢病毒载体的构建、鉴定及筛选29-31
• 3.3 YAP1上/下调对小鼠原始卵泡启动生长的影响31-32
• 3.4 HIPPO信号通路在AKT调控原始卵泡启动中的作用32-35
• 第4章 讨论35-39
• 4.1 包括组织密度梯度在内的多种机制参与原始卵泡启动的调控35
• 4.2 由组织密度梯度改变活化的HIPPO信号通路是调控原始卵泡启动的关键因子35-36
• 4.3 AKT是活化HIPPO信号通路的上游激活因子36-37
• 4.4 PI3K-AKT信号通路与HIPPO信号通路存在多种信号分子间的交叉相互作用37-38
• 4.5 HIPPO信号通路可作为卵巢功能异常治疗的重要靶标38-39
• 第5章 结论与展望39-40
• 5.1 结论39
• 5.2 展望39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 综述46-56
• 参考文献53-56

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