假结核耶尔森氏菌精氨酸依赖型抗酸系统的耐酸机理研究

发布时间：2017-05-02 13:15

  本文关键词：假结核耶尔森氏菌精氨酸依赖型抗酸系统的耐酸机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：精氨酸依赖型抗酸系统(arginine-dependent acid resistance system,AR3)是存在于多种肠道致病菌中的重要的抗酸系统,主要由精氨酸脱羧酶AdiA和逆转运蛋白AdiC组成。AdiA在对精氨酸进行脱羧反应的同时消耗细胞质内的H+生成胍基丁胺(agmatine),然后通过外膜上的AdiC运出胞外并交换新的底物精氨酸进入细胞进行下一轮反应,如此循环反应来保持细胞内的pH稳态从而使细胞在酸性环境中存活下来。假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,YP)是耶尔森氏菌属三大致病菌之一,属于比较常见的肠道致病菌,因此该菌必须能够耐受胃里的强酸环境才可以成功的侵入宿主致病。假结核耶尔森氏菌对人体宿主感染后会引起肠系淋巴结炎和慢性腹泻等疾病,有时也会引发败血症。本研究以假结核耶尔森氏菌III型(YPIII)为研究对象(其全基因组测序已经完成),对其耐强酸机制进行了探索,为其感染和传播的控制提供了理论基础。本论文主要包括以下几个方面:1.通过对YPIII野生型,突变体ΔrovM以及互补株ΔrovM-com在pH3.5酸性条件下的存活率进行比较,发现ΔrovM在加精氨酸的酸性条件下存活率明显要高于野生型,确定了LysR家族调控蛋白RovM与YPIII的抗酸有关。2.通过对YPIII野生型,突变体ΔadiA以及互补株ΔadiA-com在pH3.5酸性条件下的存活率进行比较,发现野生型与互补株的存活率在外加精氨酸的酸性环境中明显的提高,而ΔadiA的存活率则没有明显的变化;然后通过比色法测定AdiA酶活,发现加入溴甲酚蓝反应液后野生型的AdiA活性要高于ΔadiA,证明了AR3系统是通过转运H+来保持细胞内的pH稳态。3.在YPIII野生型,突变体ΔrovM以及互补株ΔrovM-com中,通过比色法测定比较AdiA酶活发现ΔrovM中的AdiA活性要高于野生型;通过构建lacZ报告基因融合菌株和qRT-PCR反应,发现ΔrovM突变体中AR3系统的表达量远高于野生型。证明RovM对AR3系统有负调控作用。4.通过对重组蛋白His6-RovM和AR3系统启动子进行体外EMSA检测,发现RovM蛋白是通过直接结合该启动子进行调控的;通过在YPIII野生型和rovM突变体中对AR3系统启动子进行截短比较分析,发现RovM在该启动子上的结合位点位于AR3系统上游-300bp左右的区域;通过DNase I footprint检测最终确定了RovM在AR3系统启动子上的特异性结合位点位于AR3启动子上游的-236bp至-309bp区域。综上所述,本研究发现假结核耶尔森氏菌在强酸性条件下是通过AR3系统将胞内H+泵出胞外来保证细胞内的稳态从而应对酸性胁迫,且该系统的表达受到LysR家族调控蛋白RovM的阻遏抑制。
【关键词】：假结核耶尔森氏菌 精氨酸依赖型抗酸系统 耐酸 RovM蛋白
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 肠道致病菌的感染以及耐酸研究意义12
• 1.2 肠道致病菌的耐酸机理研究进展12-20
• 1.2.1 大肠杆菌的耐酸机理12-19
• 1.2.1.1 大肠杆菌的耐酸系统12-15
• 1.2.1.2 大肠杆菌中的耐酸系统的调控15-19
• 1.2.2 其他肠道致病菌的耐酸机理研究19-20
• 1.3 假结核耶尔森氏菌耐酸研究现状20-23
• 1.3.1 假结核耶尔森氏菌简介20
• 1.3.2 假结核耶尔森氏菌致病性研究20-21
• 1.3.3 假结核耶尔森氏菌的耐酸研究21-23
• 1.4 本研究的意义和主要研究内容23-24
• 第二章 材料与方法24-37
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 菌株与质粒24-25
• 2.1.2 分子生物学试剂25-26
• 2.1.3 引物序列26-27
• 2.2 实验方法27-37
• 2.2.1 rovM和adiA缺失突变体构建27-31
• 2.2.1.1 rovM和adiA上下游同源臂片段扩增27-28
• 2.2.1.2 目的片段与载体的双酶切反应28
• 2.2.1.3 连接反应28-29
• 2.2.1.4 E. coli感受态制备29
• 2.2.1.5 转化29
• 2.2.1.6 菌落PCR及双酶切反应验证29-31
• 2.2.1.7 同源重组构建rovM和adiA缺失突变体31
• 2.2.2 rovM和adiA回复突变株构建31-33
• 2.2.2.1 pKT100- rovM和pKT100- adiA克隆构建31-32
• 2.2.2.2 YPIII感受态的制备32
• 2.2.2.3 转化32-33
• 2.2.3 RovM蛋白原核表达纯化33-34
• 2.2.3.1 pET15b-rovM克隆构建33
• 2.2.3.2 RovM蛋白表达纯化33-34
• 2.2.4 报告基因融合及 β-gal酶活测定34-35
• 2.2.4.1 报告基因lacZ融合菌株构建34
• 2.2.4.2 β-gal酶活测定34-35
• 2.2.5 凝胶迁移实验35
• 2.2.6 DNase I footprint检测35
• 2.2.7 精氨酸脱羧酶活性定性分析35-36
• 2.2.8 耐酸存活率测定36
• 2.2.9 实时定量PCR（qRT-PCR）测定36-37
• 第三章 实验结果37-47
• 3.1RovM参与假结核耶尔森氏菌YPIII的耐酸过程37-38
• 3.1.1 突变株 ΔrovM构建及验证37
• 3.1.2 RovM对假结核耶尔森氏菌YPIII耐酸的影响37-38
• 3.2 验证AR3系统参与假结核耶尔森氏菌YPIII耐酸过程38-40
• 3.2.1 突变株 ΔadiA及回复菌株 ΔadiA-com构建及验证38-39
• 3.2.2 通过存活率测定验证AR3系统对假结核耶尔森氏菌YPIII抗酸的影响39
• 3.2.3 精氨酸脱羧酶(AdiA)活性测定39-40
• 3.3 RovM对假结核耶尔森氏菌YPIII中AR3系统的调控40-42
• 3.3.1 RovM对精氨酸脱羧酶(AdiA)活性的调控40-41
• 3.3.2 融合启动子酶活分析RovM对AR3系统表达水平的影响41-42
• 3.3.3 qRT-PCR分析RovM对AR3系统表达水平的影响42
• 3.4 RovM对假结核耶尔森氏菌YPIII中AR3系统调控机理42-47
• 3.4.1 RovM直接结合于AR3系统启动子adip42-44
• 3.4.2 RovM蛋白在AR3系统的启动子adip上的结合位点分析44-47
• 3.4.2.1 adip启动子截短分析44-45
• 3.4.2.2 DNase I足迹法检测分析45-46
• 3.4.2.3 adip启动子分析46-47
• 第四章 分析与讨论47-49
• 第五章 总结49-50
• 参考文献50-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

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本文编号：341031