空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR快速检测

发布时间：2021-09-29 16:41

　　目的开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB双重探针实时荧光定量PCR方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检测。方法针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价,应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果建立的空肠弯曲菌TaqMan MGB双重探针实时荧光定量PCR检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA线性范围达10个数量级,最低检测限为4个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78例临床标本中定量检出28例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6株存活的空肠弯曲菌。结论 TaqMan MGB双重探针实时荧光定量PCR具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠弯曲菌定量检测,值得推广应用。 

【文章来源】：现代检验医学杂志. 2019,34(06)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

空肠弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR标准曲线、特异度、敏感度试验结果

用本研究建立的TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR对临床标本进行空肠弯曲菌检测，用阴性对照、阳性对照和灵敏度质控标准品进行有效性验证。质量控制原则：阴性对照：未出现特异性扩增曲线或Ct=Undet；阳性对照：出现特异性扩增曲线或Ct≤30.0；灵敏度质控标准品出现特异性扩增曲线且Ct值在15.0～30.0之间，以上要求必须在同一实验中同时满足，否则本次实验无效。检验结果的判定：当待测样本出现特异性扩增曲线且Ct≤35.0时为空肠弯曲菌核酸阳性；当待测样本未出现特异性扩增曲线或Ct=Undet时为空肠弯曲菌核酸阴性；对于Ct>35.0的样本，应重新检测，Ct值仍>35.0的样本判为阴性，Ct≤35.0的样本判为阳性。78份临床标本经检测：28份标本出现特异性扩增曲线且Ct<30.0，判为空肠弯曲菌核酸阳性（图2）。阳性标本中空肠弯曲菌核酸载量在4×106拷贝/μl～4×102拷贝/μl之间。由图可知，临床病人标本、猴、犬标本中空肠弯曲菌核酸载量较高，小型猪、地鼠标本中该菌核酸载量较低。临床病人1例空肠弯曲菌阳性Ct值为15.71，猴4例Ct值分别为15.72,11.7,29.75和28.28。犬5例Ct值分别为13.59,12.73,12.97,29.28和21.74。小型猪12例Ct值分别为：27.54,26.84,27.1,26.79,28.19,28.02,28.51,27.21,26.95,28.19,26.03和27.41。地鼠6例Ct值分别为：26.55,25.72,29.77,29.67,29.25和26.31。同时用普通PCR对这28例空肠弯曲菌核酸阳性标本进行flaA基因扩增，均出现1 719 bp特异性目的基因片段（图3），分子量标准为100bp DNA Ladder Marker。结果表明：普通PCR检测结果与TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测结果相一致。用细菌学检查方法仅从临床病人、猴、犬、小型猪阳性标本中分离获得6株存活的空肠弯曲菌。用普通PCR均可扩增出这6株空肠弯曲菌flaA基因特异性片段，目的片段经胶回收、连接、转化、克隆鉴定，阳性菌液测序，序列分析比对结果显示与GenBank中已公布的空肠弯曲菌flaA基因序列同源性达100%，确证为空肠弯曲菌。图3 普通PCR检测临床样本中空肠弯曲菌结果

普通PCR检测临床样本中空肠弯曲菌结果

【参考文献】：
期刊论文
[1]Reaction of antibodies to Campylobacter jejuni and cytolethal distending toxin B with tissues and food antigens[J]. Aristo Vojdani,Elroy Vojdani.  World Journal of Gastroenterology. 2019(09)



本文编号：3414065