KANSL1蛋白的真核表达纯化及功能验证

发布时间：2021-10-16 06:34

　　目的利用昆虫杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）表达KANSL1蛋白并进行纯化,同时验证该蛋白在体外对微管蛋白聚合的影响。方法构建真核表达载体pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒（Bacmid）,用脂质体转染介导Bacmid进入草地贪夜蛾细胞（Sf9 cell）,以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。随后用此重组杆状病毒感染并扩增Sf9细胞使其大量表达His-mCherry-KANSL1融合蛋白。通过镍柱亲和层析对表达的His-mCherry-KANSL1融合蛋白进行初步纯化,再经快速蛋白液相色谱（FPLC）进一步纯化,利用Western印迹、考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的表达纯化效果,最后通过体外微管聚合实验分析纯化的KANSL1蛋白对微管蛋白聚合的影响。结果质粒测序显示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒构建成功;考马斯亮蓝染色、Western印迹表明纯化得到正确的His-mCherry-KANSL1蛋白,体外微管聚合实验显示KANSL1蛋白显著促进微管蛋白的聚合。结论成功构... 

【文章来源】：军事医学. 2019,43(11)北大核心

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【部分图文】：

Western印迹检测纯化mCherryKANSL1融合蛋白

（6）：827-841.［14］FellerC，PrestelM，HartmannH，etal.TheMOFcontainingNSLcomplexassociatesgloballywithhousekeepinggenes，butactivatesonlyadefinedsubset［J］.NucleicAcidsRes，2012，40（4）：1509-1522.［15］GilissenC，HehirKwaJY，ThungDT，etal.Genomesequencingidentifiesmajorcausesofsevereintellectualdisability［J］.Nature，2014，511（7509）：344-347.（姜晓舜编辑2019-10-22收稿）图7KANSL1蛋白对微管聚合影响的免疫荧光观察（A）及微管数统计分析（B）与对照组相比，***P<0.001，n=3850

白。最后取3μl反应液涂片，显微镜下随机挑选20个视野，观察统计微管数目。11.3统计学分析采用GraphPadPrism6.0软件进行统计学分析，数据以xˉ±s表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果22.1KANSL1DNA片段的扩增以小鼠脑组织cDNA为模板，根据NCBA查询的KANSL1编码序列合成上、下游引物后，PCR扩增其编码序列。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在3100bp位置克隆出特异条带，与目的基因片段大小一致（图1）。图1KANSL1基因片段的PCR扩增M.BM15000DNA标志物；1.基因片段PCR产物22.2pFastBacHTBmCherryKANSL1重组质粒的构建与鉴定限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后的pFastBacHTBmCherry载体和KANSL1PCR产物重组连接，转化于感受态细胞E.coliDH5α，经菌落PCR鉴定、DNA测序分析和质粒抽提，初步获得pFastBacHTBmCherryKANSL1阳性重组质粒。提取质粒再次通过双酶切鉴定，在3100bp处有特异条带，符合预期结果（图2）。测序表明，重组质粒插入的目的基因序列与NCBI中目的基因序列完全一致，即获得重组阳性的pFastBacHTBmCherryKANSL1质粒。图2重组质粒pFastBacHTBmCherryKANSL1双酶切鉴定M.BM15000DNA标志物；1.BamHⅠ和NotⅠ重组质粒双酶切pFastBacHTBmCherryKANSL12.3重组BacmidKANSL1的获得将重组pFastBacHTBmCherryKANSL1转化E.coliDH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落为模板，以pUC/M13为引物进行扩增，扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图3），大小与预期848


本文编号：3439337