SIRT2稳定敲除细胞系的建立及对组蛋白修饰的影响

发布时间：2021-10-17 08:04

　　目的利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除SIRT2基因的HEK293细胞系,研究其对组蛋白不同位点的修饰情况。方法构建lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒,通过慢病毒包装,感染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选出阳性克隆。对筛选的细胞株进行T7E1验证,来验证所设计的sgRNA的有效性。应用蛋白质免疫印迹检测SIRT2蛋白水平,筛选得到SIRT2稳定敲除细胞系。使用蛋白质免疫印迹的方法在蛋白水平验证SIRT2对组蛋白乙酰化、甲基化的影响。结果通过测序证明lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒正确,T7E1验证了所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,使基因组碱基发生突变。蛋白质免疫印迹证明SIRT2敲除细胞系中SIRT2表达显著降低。在CRISPR/Cas9系统敲除SIRT2的HEK293细胞中,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第16位（H4K16ac）表达显著升高,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第5位（H4K5ac）表达下降,组蛋白H3二甲基化在赖氨酸第79位（H3K79me2）表达升高。结论获得SIRT2稳定敲除细胞系,便于后续SIRT2... 

【文章来源】：医学研究杂志. 2020,49(02)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

SIRT2敲除以后H3K79me2的水平升高

SIRT2敲除以后H4K5ac的水平降低

对SIRT2-sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链,与BsmBⅠ酶切线性化的lentiCRISPR v2质粒连接,连接产物转化到DH5ɑ感受态中,通过测序证实lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒构建成功(图1)。本文构建的lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒有SIRT2-sgRNA-4序列的插入,并且序列与所设计的一致。2.T7E1法验证SgRNA活性:


本文编号：3441421