hCUL4A过表达对缺氧/缺血—再供氧/再灌注损伤的保护作用及机制初探

发布时间：2021-10-25 05:03

　　缺氧/缺血性损伤广泛存在于包括癌症、中风以及神经退行性疾病等多种疾病中,再供氧/再灌注会导致DNA损伤的积累从而加重缺氧/缺血造成的损伤。缺氧/缺血-再供氧/再灌注会导致非正常折叠或受损蛋白的积聚,这些蛋白大多被泛素-蛋白酶体系统清除。泛素介导的蛋白降解作用由底物蛋白的泛素化以及26S蛋白酶体参与的蛋白降解构成。泛素化包括了分别由E1激活酶、E2结合酶及E3连接酶催化的泛素激活、耦联以及转移三个级联步骤。其中,E3连接酶决定了泛素化修饰的底物专一性。以cullin环为基础的E3是E3酶中最大的家族之一,Cullin4A （CUL4A）是该家族的核心成员之一。CUL4A通过参与p53、p27和Cdt1等相关蛋白的降解过程,在肿瘤抑制、细胞成活、DNA损伤响应、细胞增殖以及基因组稳定性的维持等方面发挥了重要的作用。尽管有证据暗示表达上调的Cul4A有可能参与到细胞对缺氧/缺血-再供氧/再灌注导致的损伤的响应中,但是CUL4A在这一过程中的具体作用仍不得而知。在本研究中,我们构建了人源CUL4A（human CUL4A, hCUL4A）的腺病毒表达载体,通过病毒转染将hCUL4A成功导入了P... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文縮写注释
前言
技术路线
第一章 缺氧-再供氧诱导PC12细胞Cul4A基因表达
    1.1 材料与方法
        1.1.1 材料
        1.1.2 方法
    1.2 结果
        1.2.1 缺氧系统效果评估
        1.2.2 H/R诱导PC12细胞内源性Cul4A mRNA表达
    1.3 讨论
        1.3.1 细胞系的选择
        1.3.2 评估细胞缺氧系统的有效性及稳定性
        1.3.3 PC12细胞内源性Cul4A基因对H/R的响应
第二章 人CUL4A重组腺病毒载体的构建及其在PC12细胞中的表达特点
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 结果
        2.2.1 穿梭质粒pDC315-hCUL4A-EGFP的构建
        2.2.2 pDC315-hCUL4A-EGFP质粒表达检测
        2.2.3 腺病毒包装、纯化及滴度测定
        2.2.4 PC12细胞表达hCUL4A-GFP
        2.2.5 hCUL4A-GFP融合蛋白在PC12细胞中的表达特征
    2.3 讨论
第三章 过表达人CUL4A对PC12细胞缺氧-再供氧损伤的保护作用及其机制探讨
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 结果
        3.2.1 过表达hCUL4A促进H/R后的PC12细胞存活
        3.2.2 过表达hCUL4A抑制PC12细胞H/R后DNA损伤
        3.2.3 过表达hCUL4A调节PC12细胞H/R后细胞凋亡相关蛋白的表达
    3.3 讨论
        3.3.1 CUL4A对细胞凋亡相关蛋白的影响
        3.3.2 CUL4A在H/R引起的损伤中的蛋白降解与非蛋白降解功能
第四章 过表达hCUL4A对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
    4.2 结果
        4.2.1 hCUL4A-GFP融合蛋白在大鼠脑中的表达特点
        4.2.2 hCUL4A过表达对I/R导致的脑梗塞体积及脑水肿程度的影响
        4.2.3 hCUL4A过表达对I/R导致的神经组织病理改变的影响
        4.2.4 hCUL4A过表达对I/R后大鼠神经行为的影响
    4.3 讨论
        4.3.1 CUL4A在脑I/R损伤中的作用
        4.3.2 前景与展望
结论
参考文献
附录1 pOTB7-CUL4A质粒图谱
附录2 pDC315-EGFP质粒图谱
附录3 pBHG lox ΔE1,3 Cre质粒图谱
综述 CUL4A与缺氧再供氧、缺血再灌注损伤的研究进展
    参考文献
致谢
攻读学位期间主要的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立[J]. 魏爱宣,李昕华,闫世军,何金婷,莽靖,邢影,邵延坤,徐忠信.  中国老年学杂志. 2010(03)
[2]成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究[J]. 王薇,郭灵.  广西医学. 2009(02)
[3]泛素-蛋白酶体途径的组成和功能[J]. 倪晓光,赵平.  生理科学进展. 2006(03)
[4]灌注固定大鼠的技术操作及常见问题[J]. 刘海燕.  齐齐哈尔医学院学报. 2006(11)



本文编号：3456706