CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼kctd1纯合突变体的构建

发布时间：2021-10-25 02:21

　　KCTD1（potassium channel tetramerization domain containing 1）属于钾离子通道四聚化结构域蛋白基因家族的成员,该家族成员的N端具有保守的BTB（Bric-a-brack, Tram-track, Broad complex）结构域和一个钾离子四聚体通道结构域（K-ketra）,但C端是多变的。人类KCTD基因家族成员的突变和表达异常与多种疾病相关。研究选取人类皮肤-耳朵-乳头综合征（Scalp-Ear-Nipple Syndrome,SEN）致病基因KCTD1在斑马鱼（Danio rerio）中的直系同源基因kctd1,利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除,通过F₁剪尾检测和F₁内交,成功获得kctd1 F₂纯合突变体。获得的突变体类型为+7 bp和-8 bp。研究结果对于人类KCTD1基因功能以及KCTD1致病机理的研究具有参考价值。 

【文章来源】：生物学杂志. 2019,36(05)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

靶点设计示意图注:红色碱基代表

?舛?量检测，使用2－ΔΔct法计算基因相对表达量，使用软件Graphpadprism5绘制柱状图。表2qＲT-PCＲ引物序列Table2PrimersequencesforqＲT-PCＲ基因名称Genename引物序列(5'－3')Primersequence退火温度Annealingtemperature片段大小Productsize参考文献Ｒeferenceβ-actin(F)CGAGCTGTCTTCCCATCCA(Ｒ)TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG60℃86bp［25］kctd1(F)ACGCTGAGTGGAGATAAAGCC(Ｒ)GTACCCGTTCAGAGGGAAGC60℃129bp—红框代表PAM和靶序列，黑色箭头代表Cas9切割位置图2kctd1注射敲除后T7E1酶切检测和测序分析Figure2T7E1assayandsequencinganalysisofkctd1knock-outafterinjection2结果与分析2.1F0显微注射敲除检测经过T7E1酶切检测，根据公式100×{1－sqrt［1－(b+c)/(a+b+c)］}计算敲除效率，a为未切开条带灰度值，b、c为切开条带的灰度值［26］。得出kctd1显微注射的敲除效率范围是11.60%～37.41%，将酶切成功对应的PCＲ产物进行测序，发现在靶点附近及以后出现乱峰，说明敲除成功(图2)。2.2F1突变类型检测通过F1成鱼剪尾及PCＲ产物TA克隆检测，成功获得kctd1两种突变类型，为+7bp和－8bp(图3)。2.3F2纯合突变体的筛选经过序列比对，得到F2两种突变类型的纯合突变体－8bp－/－18尾，+7bp－/－11尾，F2具体基因型统计情况如表3所示。红框代表靶序列，红色箭头代表Cas9切割位置图3F1突变类型检测Figure3GenotypeidentificationofF19第36卷第5期2019?

6］。得出kctd1显微注射的敲除效率范围是11.60%～37.41%，将酶切成功对应的PCＲ产物进行测序，发现在靶点附近及以后出现乱峰，说明敲除成功(图2)。2.2F1突变类型检测通过F1成鱼剪尾及PCＲ产物TA克隆检测，成功获得kctd1两种突变类型，为+7bp和－8bp(图3)。2.3F2纯合突变体的筛选经过序列比对，得到F2两种突变类型的纯合突变体－8bp－/－18尾，+7bp－/－11尾，F2具体基因型统计情况如表3所示。红框代表靶序列，红色箭头代表Cas9切割位置图3F1突变类型检测Figure3GenotypeidentificationofF19第36卷第5期2019年10月生物学杂志JOUＲNALOFBIOLOGYVol.36No.5Oct.2019???????????????????????????????????????????????

【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用[J]. 陆娣,李莉,邓贤明.  药学学报. 2018(01)
[2]CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及研究进展与应用[J]. 邢国杰,李桐,郑慧瑾,张玲,姜晓坤.  东北农业科学. 2017(06)
[3]CRISPR/Cas9 system: a powerful technology for in vivo and ex vivo gene therapy[J]. Xiaohui Zhang,Liren Wang,Mingyao Liu,Dali Li.  Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]Validation of Zebrafish （Danio rerio） Reference Genes for Quantitative Real-time RT-PCR Normalization[J]. Andrew DODD,Daniel LA,Warren C. MCNABB,Donald R. LOVE.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(05)



本文编号：3456457