利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asb5a基因敲除品系

发布时间：2021-11-07 13:04

　　asb5是ASB家族的成员之一,可能与动脉闭塞性疾病的发生有关。本实验室前期研究发现asb5特异性地表达于人体的心脏和骨骼肌中,且在心脏中的表达较高,提示其可能与心脏和骨骼肌发育有关,但目前对asb5基因的生物学功能未知。斑马鱼作为模式生物具有多种优势,例如体外受精、胚胎透明、发育过程可在显微镜下进行观察、与人类基因组的同源性高达70%等。本研究以斑马鱼作为研究模型,构建斑马鱼asb5基因敲除品系,为后续研究asb5基因的功能提供基础。本研究通过跨越一个内含子分别在两个外显子上各设计一个打靶位,即双靶位点敲除的方式进行敲除工作。该方法相比于单个sgRNA介导的敲除,特异性更好,且能造成大片段的缺失,也易于后续的检测。首先,对asb5基因的基本生物学信息进行初步分析表明,人类ASB5基因在斑马鱼中的同源基因有asbaa和asb5b,本研究则是以asb5a基因作为研究对象。首先分别在该基因的2号和3号外显子上各设一个打靶位点,随后在体外合成sgRNA,将其与Cas9mRNA共同显微共注射到野生型斑马鱼一细胞期胚胎的细胞中。待胚胎发育至48小时后,进行打靶有效性分析,即选择一定数量的胚胎提取... 

【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ZFNs原理示意图[36](图片引自

系统分泌一类具有ＤＮＡ结合活性的蛋白质，亦称为类转录激活效ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ?ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ，?ＴＡＬＥ）?［４４］；?ＴＡＬＥ?进入宿主细胞的活相关基因的转录以逃避其免疫系统。如图１－２所示，ＴＡＬＥ蛋白由构域、中部的ＤＮＡ特异识别与结合结构域、Ｃ端转录激活结构域组成［４５］。２０１０年，Ｃｈｒｉｓｔｉａ＃６４＃ＴＡＬＥ蛋白将Ｃ端的转录激活结构?Ｉ核酸内切酶切割结构域，即ＴＡＬＥＮｓ。ＴＡＬＥ蛋白的ＤＮＡ特异识域由该蛋白家族所特有的长的、串联排列的重复序列组成，一个重个碱基。每个重复单元由３３？３５个氨基酸残基组成，加上Ｃ端含有残基的半重复单元即可识别一个特定的核苷酸靶位点。每个重复单位氨基酸残基为重复可变双残基（Ｒｅｐｅａｔ?ｖａｒｉａｂｌｅ?ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ，ＲＶＤ）核苷酸序列的不同而改变，其余的氦基酸残基则相对保守。ＲＶＤ的Ｉ、ＮＧ、ＨＤ、ＮＮ分别识别Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ四种碱基，而ＮＨ较ＮＮ高效，特异性也更强［４７］。??＇？

利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术构建斑马鱼ＭＭａ基因敲除品系心脏中，该基因表达量最高，如图１－８所示。使用ＥｘＰＡＳｙ的Ｐｒｏ该基因所编码的氨基酸序列进行分析，可知斑马鱼所编码的化性质，也即该蛋白质的分子质量约为３６ＫＤ，理论等电点为８．４６，性值为０．０３９，加上ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＳｃａｌｅ的疏水性分析，可知该蛋白。使用ＴＭＨＭＭ在线工具进行分析，结果如图１－９所示，横坐标个氨基酸的位置，纵坐标代表该区域为跨膜区域的可能性，红线和外区域和膜内区域，两者交换位置表示此处经过了跨膜，而从图蛋白存在跨膜区域。用Ｐｈｙｒｅ２在线数据库对钙蛋白的三位结构进如图１－１０所示。??

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3481903