EV71 2A和VP1特异性单克隆抗体的制备及其对病毒复制影响的初步探究
发布时间：2021-11-19 16:13
肠道病毒EV71是引起手足口病（hand,foot and mouth disease HFMD）的主要病原体,其感染人群主要为婴幼儿,症状轻微者会出现斑丘疹和疱疹,而严重的患者会出现神经性系统疾病,如病毒性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎和急性弛缓性麻痹等,严重威胁到公共安全。本论文采用经典的单克隆抗体技术,制备和筛选了针对EV71非结构蛋白靶标2A和表面结构蛋白靶标VP1的系列单克隆抗体,并对这些抗体进行了鉴定和初步的研究分析。1.利用原核表达的2A蛋白免疫小鼠,通过细胞融合筛选分泌2A特异性IgG的杂交瘤细胞株,并根据抗体类别转换机制,采用有限稀释法进一步筛选获得2A特异性IgA型杂交瘤细胞株2A5 IgA和5F11 IgA。利用小鼠腹水制备获得大量纯化的IgA和IgG单克隆抗体,通过体外Transwell系统极化上皮细胞测定IgA抗体通过上皮细胞转运活性及其对EV71病毒复制的影响。结果表明,这两株2A特异性抗体2A5 IgA和5F11 IgA均能通过上皮细胞内转运,并有效抑制病毒复制,且这种抑制效应依赖于IgA抗体的浓度。2.采用同样的杂交瘤技术路线也筛选获得9株VP1特异性IgG杂交...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)湖北省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 EV71的流行病学介绍
1.2 EV71的病毒学特征
1.3 EV71疫苗研究现状
1.4 EV712A蛋白及其功能
1.5 黏膜免疫系统和分泌性sIgA
1.6 EV71VP1蛋白和抗体依赖性增强效应
1.7 单克隆抗体技术
1.8 利用抗体类型转换获得产IgA的杂交瘤细胞株
1.9 通透膜系统(Transwell System)模拟体内黏膜系统微环境
1.10 本研究的目的和意义
第2章 材料与方法
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验用耗材
2.1.4 生物材料
2.1.5 溶液和培养基配方
2.2 实验方法
2.2.1 肠道病毒EV71 mRNA的提取
2.2.2 pET-28a-2A和pET-28a-VP1克隆构建
2.2.3 蛋白的表达纯化及检测
2.2.4 蛋白检测
2.2.5 细胞传代培养冻存和复苏
2.2.6 细胞融合
2.2.7 杂交瘤细胞上清检测(ELISA)
2.2.8 融合细胞的单克隆化
2.2.9 有限稀释法筛选IgA分泌型单克隆杂交瘤细胞株
2.2.10 免疫荧光验证IgG/IgA分泌型单克隆杂交瘤细胞株的特异性
2.2.11 腹水制备与抗体纯化
2.2.12 Transwell模型培养极化的上皮细胞
2.2.13 Transwell极化细胞的生长和电阻的测定
2.2.14 Transwell中的抗体效应实验
2.2.15 经典中和实验检测VP1-IgGs的体外中和活性
2.2.16 THP-1细胞中验证病毒的抗体依赖性增强作用
第3章 实验结果
3.1 EV712A特异性IgA单克隆抗体的制备及其对病毒复制的影响
3.1.1 EV71BrCr株2A蛋白原核表达克隆构建
3.1.2 EV71 2A蛋白的诱导表达纯化和鉴定
3.1.3 EV71 2A特异性杂交瘤细胞的筛选和鉴定
3.1.4 利用竞争性ELISA验证2A蛋白单克隆抗体识别表位
3.1.5 利用抗体类型转换筛选特异性的产IgA的杂交瘤细胞株
3.1.6 腹水制备与抗体纯化
3.1.7 IgA抗体在Transwell系统中的定向转运
3.1.8 EV71在Transwell系统中的复制曲线的测定
3.1.9 2A-IgA在Transwell系统中的胞内中和测定
3.1.10 2AIgA胞内中和的浓度依赖效应
3.2 EV71 VP1特异性IgG单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
3.2.1 EV71 BrCr株VP1蛋白原核表达克隆构建
3.2.2 EV71 VP1蛋白的诱导表达纯化和鉴定
3.2.3 EV71 VP1特异性杂交瘤细胞的筛选和鉴定
3.2.4 利用竞争性ELISA验证VP1单克隆抗体识别表位
3.2.5 检测VP1-IgGs对VP1消化的小片段多肽的识别表位
3.2.6 VP1-IgGs腹水制备与抗体纯化
3.2.7 VP1-IgGs体外中和实验
3.2.8 VP1-IgGs协同中和实验
3.2.9 EV71在THP-1细胞中的复制曲线测定
3.2.10 EV71 VP1-IgGs在THP-1细胞中的对病毒复制的影响
3.2.11 WesternBlot鉴定EV71-VP1 IgGs识别VP1抗原表位
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.1.1 EV712A特异性IgA单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
4.1.2 EV71VP1特异性IgG单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
4.2 讨论
4.2.1 关于EV71非结构蛋白作为免疫靶标的选择
4.2.2 EV71抗体依赖性增强效应的测定
4.3 展望
参考文献
致谢
附录 常用缩写
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
本文编号：3505400
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)湖北省
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 引言
1.1 EV71的流行病学介绍
1.2 EV71的病毒学特征
1.3 EV71疫苗研究现状
1.4 EV712A蛋白及其功能
1.5 黏膜免疫系统和分泌性sIgA
1.6 EV71VP1蛋白和抗体依赖性增强效应
1.7 单克隆抗体技术
1.8 利用抗体类型转换获得产IgA的杂交瘤细胞株
1.9 通透膜系统(Transwell System)模拟体内黏膜系统微环境
1.10 本研究的目的和意义
第2章 材料与方法
2.1 实验仪器与材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验用耗材
2.1.4 生物材料
2.1.5 溶液和培养基配方
2.2 实验方法
2.2.1 肠道病毒EV71 mRNA的提取
2.2.2 pET-28a-2A和pET-28a-VP1克隆构建
2.2.3 蛋白的表达纯化及检测
2.2.4 蛋白检测
2.2.5 细胞传代培养冻存和复苏
2.2.6 细胞融合
2.2.7 杂交瘤细胞上清检测(ELISA)
2.2.8 融合细胞的单克隆化
2.2.9 有限稀释法筛选IgA分泌型单克隆杂交瘤细胞株
2.2.10 免疫荧光验证IgG/IgA分泌型单克隆杂交瘤细胞株的特异性
2.2.11 腹水制备与抗体纯化
2.2.12 Transwell模型培养极化的上皮细胞
2.2.13 Transwell极化细胞的生长和电阻的测定
2.2.14 Transwell中的抗体效应实验
2.2.15 经典中和实验检测VP1-IgGs的体外中和活性
2.2.16 THP-1细胞中验证病毒的抗体依赖性增强作用
第3章 实验结果
3.1 EV712A特异性IgA单克隆抗体的制备及其对病毒复制的影响
3.1.1 EV71BrCr株2A蛋白原核表达克隆构建
3.1.2 EV71 2A蛋白的诱导表达纯化和鉴定
3.1.3 EV71 2A特异性杂交瘤细胞的筛选和鉴定
3.1.4 利用竞争性ELISA验证2A蛋白单克隆抗体识别表位
3.1.5 利用抗体类型转换筛选特异性的产IgA的杂交瘤细胞株
3.1.6 腹水制备与抗体纯化
3.1.7 IgA抗体在Transwell系统中的定向转运
3.1.8 EV71在Transwell系统中的复制曲线的测定
3.1.9 2A-IgA在Transwell系统中的胞内中和测定
3.1.10 2AIgA胞内中和的浓度依赖效应
3.2 EV71 VP1特异性IgG单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
3.2.1 EV71 BrCr株VP1蛋白原核表达克隆构建
3.2.2 EV71 VP1蛋白的诱导表达纯化和鉴定
3.2.3 EV71 VP1特异性杂交瘤细胞的筛选和鉴定
3.2.4 利用竞争性ELISA验证VP1单克隆抗体识别表位
3.2.5 检测VP1-IgGs对VP1消化的小片段多肽的识别表位
3.2.6 VP1-IgGs腹水制备与抗体纯化
3.2.7 VP1-IgGs体外中和实验
3.2.8 VP1-IgGs协同中和实验
3.2.9 EV71在THP-1细胞中的复制曲线测定
3.2.10 EV71 VP1-IgGs在THP-1细胞中的对病毒复制的影响
3.2.11 WesternBlot鉴定EV71-VP1 IgGs识别VP1抗原表位
第4章 结论与展望
4.1 结论
4.1.1 EV712A特异性IgA单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
4.1.2 EV71VP1特异性IgG单克隆抗体的筛选及其对病毒复制的影响
4.2 讨论
4.2.1 关于EV71非结构蛋白作为免疫靶标的选择
4.2.2 EV71抗体依赖性增强效应的测定
4.3 展望
参考文献
致谢
附录 常用缩写
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
本文编号：3505400
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/3505400.html
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