蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白1基因的克隆与原核表达

发布时间：2022-01-02 17:50

　　目的克隆并原核表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lambia,简称贾第虫）末端结合蛋白1（End-binding protein 1,geb1）基因,获得重组gEB1蛋白。方法由于geb1基因无内含子,我们以C2株贾第虫基因组为模板,以国际标准株WB株geb1基因序列为参考序列,设计引物克隆geb1基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切与原核表达载体p ET-28α（+）连接,转化感受态E.coli TOP10,经筛选和测序验证后导入大肠杆菌E.coli Rosetta（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导gEB1蛋白表达,产物经SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建了表达C2株贾第虫geb1基因的原核表达载体pET-28α（+）-gEB1,转化入大肠杆菌E.coli Rosetta（DE3）,重组菌株经0.1 mmol/L IPTG,30℃低温诱导5 h,SDS-PAGE和Western blot显示,在相对分子量约29 KDa的位置出现目的蛋白条带,与理论值一致。结论用大肠杆菌成功表达了gEB1蛋白,为gEB1蛋白的功能研究和抗体制... 

【文章来源】：热带病与寄生虫学. 2020,18(01)

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

geb1基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

目的基因经双酶切后与pET-28α(+)相连，连接产物转化E.Coli TOP10，阳性克隆提取质粒后经Nco I和Xho I双酶切鉴定，电泳分别可见约760 bp的geb1基因目的片段、约5 300 bp的载体pET-28α(+)两条电泳条带(图2)，与预期结果一致，将进一步测序验证正确的质粒命名为p ET-28α(+)-gEB1。3 geb1基因的诱导表达和鉴定

重组质粒pET-28α(+)-gEB1转化E.coli Rosetta(DE3),0.1 m M IPTG诱导表达5 h，并将所得产物煮沸裂解进行SDS-PAGE实验，以未诱导的重组质粒转化菌作为对照，SDS-PAGE验证重组蛋白的表达结果(图3)。结果显示诱导菌在分子量29 kDa处有出现一条明显的条带，而未诱导菌没有此条带，与预期相符合(图4)。Western blot确认此条带确为gEB1-His Tag融合蛋白。图4 geb1基因融合蛋白Western blot分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库的构建[J]. 刘绍伟,王洋,田喜凤.  河北医科大学学报. 2018(01)
[2]蓝氏贾第鞭毛虫α-4贾第素诱饵蛋白质粒构建[J]. 刘绍伟,王洋,田喜凤.  华北理工大学学报(医学版). 2017(06)
[3]蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 章乐生,孙磊,胡媛,巩文词,王燕娟,沈玉娟,徐馀信,汪天平,曹建平.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2017(02)

硕士论文
[1]pSupper1300-EB1c-GFP重组质粒的构建及转基因植株的筛选[D]. 刘佳雨.山西师范大学 2016



本文编号：3564614