Alpha B-crystallin与ATP6V1A相互作用调控溶酶体活性的分子机制研究
发布时间：2022-01-14 07:19
背景在真核生物细胞中,溶酶体是细胞内基本的消化器官,其腔内维持酸性环境,PH约为5,内含50多种水解酶来降解吞噬进来的物质。据报道,溶酶体酸化机制失调是许多溶酶体贮积病（LSDs）、退行性疾病的发病机理。溶酶体酸性机制由V-ATPase复合体调节,质子泵由ATP驱动,存在于真核生物的胞内和细胞膜上,主要负责建立和维持细胞内的酸性PH,并以ATP依赖的方式将H﹢注入细胞腔内。V-ATPase是溶酶体膜上的可逆组装V1/V0质子泵,是一个多亚基复合体,包括位于细胞质的V1复合体和锚定于溶酶体膜上的V0复合体。V1包括至少八个不同的亚基（A-H）,ATP水解的三个催化位点由A和B亚基组成,V0区包含亚基a、c、c’、c"、d和e,负责质子跨膜转运。ATP6V1A基因编码V-ATPase质子泵的一个组成成分,即定位于质子泵上V1区的A亚基。前期实验中,我们发现HSF4通过维持溶酶体酸性PH,上调溶酶体活性。HSF4调控晶状体上皮细胞中小热休克蛋白（比如,HSP25和CRYAB）的表达。HSP 25和alpha B-crystallin作为分子伴侣,在蛋白质质量控制的各个方...
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在晶状体上皮细胞中过表达HSF4b，ATP6V1A的蛋白水平明显升高，RNA水平无明显变化，蛋白的稳定性增强
2.3 Alpha B-crystallin 缺失促进 ATP6V1A 的泛素化，促其通过泛素蛋白酶体途径降解。（/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 三种细胞分别计数，铺于 6 cm 皿中，8×12～24 h后，全部用50μg/ml的CHX处理的同时，分别用20 μm/ml CQ和10 μm/ml MG13lec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 各一皿，6h 后，SDS Lysis Buffer 裂解细胞，再对相关蛋白进行 Wes。β-actin 为内参。（B）将 mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 计数，铺于两个 10 cm 皿，2.2×106/～24 h 后，将其中一皿用 10 μm/ml MG132 处理 8 h，NP40 Lysis Buffer 裂解细胞后，用免TP6V1A，Western blot 检测 Ubiquitin。Input 为阳性对照。（C）mlec/HA-Hsf4-Hsf4b/sh-cryαB 计数后，分别铺与 6 cm 皿，8×105/皿，培养 12～24 h 后，各取一皿用 10 um 处理 8 h 后，用 Ubiquitin beads 拉 ATP6V1A。Input 为阳性对照。
TP6V1A 与 alpha B-crystallin 共分布在溶酶体上。（A）用溶酶体富集试剂盒法分离 mlec/Hsf4b-/-和 mlec/HA-Hsf4b 中的溶酶体，再对相关蛋白进行 Wes作为溶酶体标记物，beat-actin 作为细胞总裂解液标记物。（B）将 mlec/HA-个于 chamber 中，培养 12～24 h，将细胞固定后做免疫荧光。ATP6V1A 染红lin 染绿色 488，蓝色 DAPI 染核。lpha B-crystallin 只与 ATP6V1A 亚基相互作用确定 alpha B-crystallin 与 ATP6V1A 发生相互作用，只不过 V-AT合体，V1 就由 8 个亚基(a-h)组成，负责 ATP 水解。V1 结构域的 结构域旋转一周提供了所需能量，推动 2-4 个位于胞质 H+穿过膜的影响[10]。V-ATPase 质子泵是多亚基协同维护溶酶体内的酸性ha B-crystallin 与 ATP6V1A 发生相互作用的同时，也想知道 V-AT是否与 alpha B-crystallin 相互作用。我们运用 GST Pull down 检 V-ATPase 质子泵的其他亚基的相互作用，Western blot 结果显示，G
【参考文献】：
期刊论文
[1]Huntingtin Cleavage Induced by Thrombin In Vitro[J]. Fang LIN;Junchao WU;Yan WANG;and Zhenghong QIN Department of Pharmacology,Laboratory of Aging and Nervous Diseases,Soochow University School of Medicine,Suzhou 215123,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(01)
本文编号：3588071
【文章来源】：河南大学河南省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
在晶状体上皮细胞中过表达HSF4b，ATP6V1A的蛋白水平明显升高，RNA水平无明显变化，蛋白的稳定性增强
2.3 Alpha B-crystallin 缺失促进 ATP6V1A 的泛素化，促其通过泛素蛋白酶体途径降解。（/Hsf4b-/-、mlec/HA-Hsf4b、mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 三种细胞分别计数，铺于 6 cm 皿中，8×12～24 h后，全部用50μg/ml的CHX处理的同时，分别用20 μm/ml CQ和10 μm/ml MG13lec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 各一皿，6h 后，SDS Lysis Buffer 裂解细胞，再对相关蛋白进行 Wes。β-actin 为内参。（B）将 mlec/HA-Hsf4b/sh-cryαB 计数，铺于两个 10 cm 皿，2.2×106/～24 h 后，将其中一皿用 10 μm/ml MG132 处理 8 h，NP40 Lysis Buffer 裂解细胞后，用免TP6V1A，Western blot 检测 Ubiquitin。Input 为阳性对照。（C）mlec/HA-Hsf4-Hsf4b/sh-cryαB 计数后，分别铺与 6 cm 皿，8×105/皿，培养 12～24 h 后，各取一皿用 10 um 处理 8 h 后，用 Ubiquitin beads 拉 ATP6V1A。Input 为阳性对照。
TP6V1A 与 alpha B-crystallin 共分布在溶酶体上。（A）用溶酶体富集试剂盒法分离 mlec/Hsf4b-/-和 mlec/HA-Hsf4b 中的溶酶体，再对相关蛋白进行 Wes作为溶酶体标记物，beat-actin 作为细胞总裂解液标记物。（B）将 mlec/HA-个于 chamber 中，培养 12～24 h，将细胞固定后做免疫荧光。ATP6V1A 染红lin 染绿色 488，蓝色 DAPI 染核。lpha B-crystallin 只与 ATP6V1A 亚基相互作用确定 alpha B-crystallin 与 ATP6V1A 发生相互作用，只不过 V-AT合体，V1 就由 8 个亚基(a-h)组成，负责 ATP 水解。V1 结构域的 结构域旋转一周提供了所需能量，推动 2-4 个位于胞质 H+穿过膜的影响[10]。V-ATPase 质子泵是多亚基协同维护溶酶体内的酸性ha B-crystallin 与 ATP6V1A 发生相互作用的同时，也想知道 V-AT是否与 alpha B-crystallin 相互作用。我们运用 GST Pull down 检 V-ATPase 质子泵的其他亚基的相互作用，Western blot 结果显示，G
【参考文献】：
期刊论文
[1]Huntingtin Cleavage Induced by Thrombin In Vitro[J]. Fang LIN;Junchao WU;Yan WANG;and Zhenghong QIN Department of Pharmacology,Laboratory of Aging and Nervous Diseases,Soochow University School of Medicine,Suzhou 215123,China. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2007(01)
本文编号：3588071
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