贝伐株单克隆抗体制备工艺及质量研究

发布时间：2017-05-12 09:19

  本文关键词：贝伐株单克隆抗体制备工艺及质量研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：贝伐株单克隆抗体是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药,用于多种癌症的治疗。本课题的目的是研究开发贝伐株单克隆抗体的制备工艺,并通过质量研究确证其分子结构、质量属性及稳定性,为商业化生产奠定基础,进而使国人能够获得用得起的国产良药,提高患者的生活质量。采用重组DNA技术,人工合成贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因,将此克隆的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效逆转录病毒前载体,将获得重链表达前载体和轻链表达前载体分别与病毒包装质粒p HCMV-G共转染包装细胞293GP,制备获得两种分别携带有贝伐株单克隆抗体重链与轻链基因的逆转录病毒载体。两种逆转录病毒载体先后交替转导CHO-S细胞,获得可稳定表达贝伐株单克隆抗体的工程细胞。应用先进的细胞培养技术,经过细胞的扩增培养和发酵表达培养,在哺乳动物细胞表达系统中国仓鼠卵巢细胞中产生贝伐珠单抗,然后采用包括病毒灭活和去除步骤在内的纯化工艺进行纯化,再经过配制、除菌过滤、无菌灌装等制剂生产工艺获得成品。通过多次实验对细胞培养工艺、纯化工艺及制剂生产工艺的各个工艺参数进行不断的摸索和优化,最终确定了高效表达贝伐株单克隆抗体的生产工艺。并对该工艺条件下生产出来的原液和成品进行了质量分析和稳定性研究,各检测结果均合格,工程细胞株传代稳定性良好,细胞培养表达量高,纯化工艺获得的原液纯度高,本品7批中试原液和成品的质量研究表明本品批间高度一致;和上市对照品AVASTIN#174;的一级氨基酸序列完全一致,在模仿AVASTIN#174;制剂处方的基础上,进行了优化,优化后的处方优于AVASTIN#174;的处方。3批结构确证和质量属性(其中N-糖糖谱分析、糖基化位点分析、二硫键配对分析为1批)研究结果表明本品批间高度一致性且和上市对照品高度相似。本课题研究获得的贝伐株单克隆抗体高效表达的制备工艺可实现,且能够持续稳定的生产出与原研药高度相似的产品,该制备工艺可以用于规模化生产,本项目可以进一步开展临床申报工作。
【关键词】：重组DNA技术 单克隆抗体 工程细胞 质量属性 高度相似
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 提要4-5
• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词表8-14
• 引言14-15
• 第1章 综述15-20
• 1.1 抗体药物的发展历程15-16
• 1.2 抗体药物的应用进展16-17
• 1.3 贝伐株单抗的临床应用17-18
• 1.4 贝伐株单抗的研究进展18-19
• 1.5 贝伐株单抗制备工艺的研究思路19-20
• 第2章 贝伐株单克隆抗体制备工艺研究20-69
• 2.1 实验材料20
• 2.1.1 主要试剂与耗材20
• 2.1.2 主要仪器设备20
• 2.2 实验方法20-31
• 2.2.1 工程细胞的构建和鉴定20-21
• 2.2.2 细胞培养工艺研究21-28
• 2.2.2.1 培养基成分的筛选21-22
• 2.2.2.2 培养基成分的优化22-27
• 2.2.2.3 细胞生长和产物分泌规律27
• 2.2.2.4 接种量研究27
• 2.2.2.5 培养条件的优化和确定27-28
• 2.2.3 细胞培养工艺的放大28
• 2.2.3.1 细胞放大体积（倍数）28
• 2.2.3.2 控制参数的放大28
• 2.2.4 纯化工艺研究28-30
• 2.2.4.1 样品粗分离28-29
• 2.2.4.2 超滤浓缩及缓冲液置换29
• 2.2.4.3 Mabselect Sure亲和层析29
• 2.2.4.4 低p H孵放法灭活病毒29
• 2.2.4.5 Q-FF阴离子交换层析29
• 2.2.4.6 阳离子交换层析29-30
• 2.2.4.7 纳滤法除病毒过滤30
• 2.2.5 纯化工艺的放大30
• 2.2.6 制剂工艺研究30-31
• 2.2.6.1 制剂配方的选择与确定30-31
• 2.2.6.2 制剂稳定性研究31
• 2.3 结果与讨论31-69
• 2.3.1 细胞培养工艺研究31-44
• 2.3.1.1 培养基的筛选31-33
• 2.3.1.2 培养基成分的优化33-39
• 2.3.1.3 细胞生长和产物分泌规律39-40
• 2.3.1.4 接种量研究40-41
• 2.3.1.5 培养条件的优化和确定41-44
• 2.3.2 纯化工艺研究44-65
• 2.3.2.1 样品粗分离44
• 2.3.2.2 超滤浓缩及缓冲液置换44-45
• 2.3.2.3 Mabselect Sure亲和层析45-49
• 2.3.2.4 低p H孵放法灭活病毒49-52
• 2.3.2.5 Q-FF阴离子交换层析52-55
• 2.3.2.6 阳离子交换层析55-64
• 2.3.2.7 纳滤法除病毒过滤64-65
• 2.3.3 纯化工艺的放大65-66
• 2.3.3.1 固液分离的参数放大66
• 2.3.3.2 纯化层析柱参数的放大66
• 2.3.3.3 纯化层析操作参数的放大66
• 2.3.4 制剂工艺研究66-69
• 2.3.4.1 制剂配方的确定66
• 2.3.4.2 制剂稳定性研究66-69
• 第3章 贝伐株单克隆抗体质量研究69-112
• 3.1 实验材料69
• 3.1.1 主要试剂与耗材69
• 3.1.2 主要仪器设备69
• 3.2 实验方法69-80
• 3.2.1 贝伐株单抗原液质量研究69-74
• 3.2.1.1 p H值69-70
• 3.2.1.2 蛋白质含量[25]70
• 3.2.1.3 生物学活性[26]70-71
• 3.2.1.4 还原型电泳纯度71
• 3.2.1.5 非还原型电泳纯度71
• 3.2.1.6 纯度（分子排阻色谱法）71
• 3.2.1.7 电荷异构体（离子交换色谱法）71-72
• 3.2.1.8 赖氨酸变体（离子交换色谱法）72
• 3.2.1.9 分子量72
• 3.2.1.10 紫外光谱扫描72-73
• 3.2.1.11 等电点73
• 3.2.1.12 外源性DNA残留量（q PCR法）73
• 3.2.1.13 CHO细胞蛋白质残留量[27]73
• 3.2.1.14 蛋白A残留量73-74
• 3.2.1.15 细菌内毒素检查74
• 3.2.1.16 肽图74
• 3.2.2 贝伐株单抗成品质量研究74-78
• 3.2.2.1 鉴别实验75
• 3.2.2.2 外观75
• 3.2.2.3 可见异物75
• 3.2.2.4 不溶性微粒检查75
• 3.2.2.5 渗透压摩尔浓度75
• 3.2.2.6 装量75
• 3.2.2.7 pH值75
• 3.2.2.8 聚山梨酯80含量75
• 3.2.2.9 蛋白质含量75-76
• 3.2.2.10 生物学活性76
• 3.2.2.11 还原型电泳纯度76
• 3.2.2.12 非还原型电泳纯度76-77
• 3.2.2.13 纯度（分子排阻色谱法）77
• 3.2.2.14 电荷异构体（离子交换色谱法）77
• 3.2.2.15 赖氨酸变体（离子交换色谱法）77-78
• 3.2.2.16 无菌检查78
• 3.2.2.17 细菌内毒素检查78
• 3.2.2.18 异常毒性检查78
• 3.2.3 原液稳定性研究[28]78-79
• 3.2.4 成品稳定性研究79-80
• 3.3 结果与讨论80-112
• 3.3.1 贝伐株单抗原液质量研究80-96
• 3.3.1.1 p H值80-81
• 3.3.1.2 蛋白质含量81-82
• 3.3.1.3 生物学活性82-84
• 3.3.1.4 还原型电泳纯度84-85
• 3.3.1.5 非还原型电泳纯度85
• 3.3.1.6 纯度（分子排阻色谱法）85-86
• 3.3.1.7 电荷异构体（离子交换色谱法）86-88
• 3.3.1.8 赖氨酸变体（离子交换色谱法）88
• 3.3.1.9 分子量88-90
• 3.3.1.10 紫外光谱扫描90
• 3.3.1.11 等电点90
• 3.3.1.12 外源性DNA残留量（q PCR法）90-91
• 3.3.1.13 CHO细胞蛋白质残留量91-92
• 3.3.1.14 蛋白A残留量92-93
• 3.3.1.15 细菌内毒素检查93-94
• 3.3.1.16 肽图94-96
• 3.3.2 贝伐株单抗成品质量研究96-109
• 3.3.2.1 鉴别实验96
• 3.3.2.2 外观96
• 3.3.2.3 可见异物96-97
• 3.3.2.4 不溶性微粒检查97-98
• 3.3.2.5 渗透压摩尔浓度98-99
• 3.3.2.6 装量99
• 3.3.2.7 p H值99-100
• 3.3.2.8 聚山梨酯80含量100
• 3.3.2.9 蛋白质含量100-101
• 3.3.2.10 生物学活性101-102
• 3.3.2.11 还原型电泳纯度102-103
• 3.3.2.12 非还原型电泳纯度103
• 3.3.2.13 纯度（分子排阻色谱法）103-104
• 3.3.2.14 电荷异构体（离子交换色谱法）104-105
• 3.3.2.15 赖氨酸变体（离子交换色谱法）105-106
• 3.3.2.16 无菌检查106
• 3.3.2.17 细菌内毒素检查106-107
• 3.3.2.18 异常毒性检查107-109
• 3.3.3 贝伐株单抗原液稳定性研究109-110
• 3.3.3.1 反复冻融实验109
• 3.3.3.2 贝伐珠单抗原液加速实验109-110
• 3.3.3.3 贝伐株单抗原液长期实验110
• 3.3.4 贝伐株单抗成品稳定性研究110-112
• 3.3.4.1 光照实验110
• 3.3.4.2 高温实验110-111
• 3.3.4.3 冻融实验111-112
• 第4章 结论112-117
• 4.1 生产用原材料研究112
• 4.2 原液生产工艺研究112-113
• 4.3 制剂处方及工艺研究113-114
• 4.4 质量研究及稳定性研究114-115
• 4.4.1 质量研究114
• 4.4.2 稳定性研究114-115
• 4.4.2.1 原液稳定性114
• 4.4.2.2 成品稳定性114-115
• 4.4.3 结构确证和质量属性研究115
• 4.5 综合分析和评价115-117
• 参考文献117-119
• 作者简介119-120
• 致谢120

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 胡春艳;刘全忠;;单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J];安徽预防医学杂志;2008年02期

2 冯洁;;介绍几种抗肿瘤的靶向新药[J];中国药师;2006年02期

  本文关键词：贝伐株单克隆抗体制备工艺及质量研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：359385