融合SUMO标签表达纯化HSA单链抗体及其结构分析

发布时间：2022-10-23 20:15

　　人血清白蛋白（Human serum albumin,HSA）是存在于人血浆中的一种蛋白质,含量丰富,常作为载体蛋白,具有结合和运输的作用。HSA在人体内的半衰期长,可用于融合多肽药物蛋白从而延长药物的半衰期,但HSA融合多肽药物后分子量大,表达困难,也不易穿过血管壁,因此课题研究了新的抗HSA的单链抗体,单链抗体（Single-Chain Antibody Fragment,scFv）相比于完整的抗体分子,具有分子量小、组织穿透性好、结构中无糖基化修饰等特点,适用于大肠杆菌进行表达和纯化,相比于采用哺乳动物细胞表达,周期短,培养成本低。但大肠杆菌表达scFv也有存在着一些问题,如表达量低,难以可溶性表达等。本文通过HSA免疫小鼠进而制备杂交瘤细胞,通过测序得到抗HSA抗体的序列。将小泛素相关修饰物（Small ubiquitin-related modifier,SUMO）标签用于scFv的表达,使用表达的泛素样特异性蛋白酶（Ubiquitin-like specific protease,Ulp1）进行标签切除,成功得到了可溶性的scFv,并对scFv进行了结构分析。主要研究成果如... 

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词
第一章 绪论
    1.1 抗体结构简介
    1.2 抗体分子的形式及其研究进展
    1.3 单链抗体在大肠杆菌中的表达纯化
    1.4 重组蛋白融合技术在大肠杆菌中的运用
        1.4.1 重组蛋白融合技术的优点
        1.4.2 重组蛋白融合技术的缺点
    1.5 SUMO简介
    1.6 SUMO蛋白酶简介
    1.7 SUMO标签及SUMO蛋白酶Ulp1在大肠杆菌表达中的运用
    1.8 HSA用于多肽药物半衰期的延长
    1.9 课题研究内容
        1.9.1 课题的来源和意义
        1.9.2 本课题的主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 宿主菌及质粒
        2.1.2 实验主要试剂和仪器
        2.1.3 主要溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 抗HSA抗体的制备、纯化和检测
        2.2.2 大肠杆菌感受态的制备
        2.2.3 大肠杆菌表达scFv重组菌株的构建
        2.2.4 大肠杆菌表达SUMO-scFv重组菌株的构建
        2.2.5 scFv和SUMO-scFv的表达
        2.2.6 表达SUMO蛋白酶Ulp1菌株的构建、表达条件优化及表达量测定
        2.2.7 SUMO蛋白酶Ulp1的Western blotting检测
        2.2.8 SUMO蛋白酶Ulp1的纯化
        2.2.9 Ulp1酶活测定及酶活特性分析
        2.2.10 融合蛋白SUMO-scFv及scFv纯化
        2.2.11 抗体建模
第三章 结果与讨论
    3.1 抗HSA抗体的制备及scFv的表达
        3.1.1 抗HSA抗体的制备及亲和力检测
        3.1.2 1H11抗体scFv的初步表达
        3.1.3 融合蛋白SUMO-scFv的表达菌株构建
        3.1.4 SUMO-scFv的表达和纯化
    3.2 SUMO蛋白酶Ulp1的表达纯化及活性分析
        3.2.1 表达Ulp1的重组菌株的构建
        3.2.2 Ulp1的表达条件优化及Western blotting鉴定
        3.2.3 SUMO蛋白酶Ulp1的纯化
        3.2.4 Ulp1酶活测定底物SUMO-EGFP的表达与纯化
        3.2.5 Ulp1酶活测定及酶活特性分析
    3.3 融合蛋白SUMO-scFv的酶切及scFv的纯化
    3.4 抗体与抗原HSA同源建模分析
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]人-鼠嵌合单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的高效可溶性表达和发酵条件优化[J]. 刘萌,孙杨,杨艳坤,白仲虎.  生物学杂志. 2016(06)
[2]米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 马俊阳,诸葛斌,方慧英,宗红,孙进,龚星慧,诸葛健,楼笑笑,冯倩.  微生物学通报. 2014(01)
[3]融合蛋白GST-Ulp1p在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定[J]. 傅俊华,王琪,尹杰超,刘铭瑶,李宁,姚文斌,任桂萍,李璐,李德山.  生物工程学报. 2010(06)
[4]SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定[J]. 陈兴华,李校堃,苏志坚,苏烨,冯娅,肖业臣,孟绢,王艳萍,黄亚东.  中国生物工程杂志. 2007(03)



本文编号：3697051