Cbl-b/c-Cbl在肺泡巨噬细胞炎症调控中的作用及机制研究
发布时间：2022-11-05 17:39
众所周知,E3泛素连接酶通过对蛋白的泛素化修饰,从而在先天免疫和适应性免疫调控中发挥重要作用。Cbl蛋白家族是一类具有RING-finger结构域的E3泛素连接酶,在许多物种中都是高度保守的,主要由酪氨酸激酶结合结构域（tyrosine kinase binding domain,PTB）、环指结构域（RING finger domain）、脯氨酸富集区（a proline-rich region）和一段连接区域构成,在哺乳动物中主要有三个成员:c-Cbl,Cbl-b和Cbl-c,在其造血系统中主要表达Cbl-b和c-Cbl。到目前为止已有大量的证据证明这两个分子在淋巴细胞的发育和活化中起着重要的作用,且与Cbl相关的信号通路在细胞的增殖、分化以及细胞形态中都发挥着巨大的作用。巨噬细胞是造血系统中可塑性最强的免疫细胞,存在于所有的组织中,并且具有极强的功能多样性。在机体发育、自身稳定、损伤修复及免疫应答中均发挥很重要的作用。通过骨髓嵌合体的实验研究发现:当给野生型（WT）和Cbl-b敲除（Cbl-b-/-）小鼠注射巯基乙酸盐后,Cbl-b-/-敲除小鼠腹膜中巨噬细胞的招募能力增强;也有...
【文章页数】：104 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 分子生物学试剂
2.1.2 细胞培养相关试剂及材料
2.1.3 抗体和细胞因子
2.1.4 小鼠
2.1.5 主要实验仪器
2.1.6 相关引物
2.2 实验方法
2.2.1.基因组DNA抽提与鉴定：（从小鼠尾巴中抽提全基因组DNA）
2.2.2.骨髓单个悬浮细胞的制备
2.2.3.BMDM的培养
2.2.4.细胞表面染色：用于流式分析
2.2.5 流式细胞分选
2.2.6.Western blot
2.2.7 免疫磁珠分选
2.2.8 RNA抽提
2.2.9 cDNA的制备
2.2.10 实时荧光定量PCR
2.2.11 质粒构建
2.2.12 胶回收
2.2.13 限制性酶切
2.2.14 感受态细菌的制备和质粒的转化
2.2.15 质粒DNA小量抽取
2.2.16 质粒DNA大量抽取
2.2.17 脂质体转染
2.2.18 免疫共沉淀
2.2.19 石蜡切片制备
2.2.20 苏木素-伊红(H&E)染色
2.2.21 天狼猩红染色
2.2.22 免疫荧光染色
2.2.23 刘氏染色法
2.2.24 银染
2.2.25 Brdu染色检测细胞增殖
2.2.26 Annexin V染色检测细胞凋亡
第三章 Cbl /c-Cbl在巨噬细胞中双敲除的小鼠模型的建立与鉴定
3.1 巨噬细胞活化后Cbl-b和c-Cbl的表达量升高
3.2 巨噬细胞中c-Cbl/Cbl-b双敲除小鼠模型的建立与鉴定
3.2.1 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的PCR鉴定
3.2.2 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的Western blot鉴定
3.3 小结
第四章 Cbl-b/c-Cbl在巨噬细胞中双敲除小鼠的表型分析
4.1 Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠生存曲线
4.2 Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠肺损伤及其鉴定
4.3 双敲除小鼠肺灌洗液中肺泡巨噬细胞的表型分析
4.4 双敲除小鼠肺灌洗液中其他免疫细胞的表型分析
4.5 双敲除小鼠脾脏和胸腺中T细胞的表型分析
4.6 双敲除小鼠脾脏和骨髓中B细胞的表型分析
4.7 双敲除小鼠脾脏和骨髓中DC的表型分析
4.8 双敲除小鼠脾脏和骨髓中粒细胞的表型分析
4.9 双敲除小鼠脾脏和骨髓中巨噬细胞的表型分析
4.10 双敲除小鼠血液中单核细胞和粒细胞的表型分析
4.11 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞的活化
4.12 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞的增殖和凋亡
4.13 双敲除小鼠肺灌洗液中细胞因子及趋化因子受体的检测
4.14 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞会诱导WT小鼠肺损伤
4.15 小结
第五章 Cbl-b/c-Cbl对巨噬细胞炎症调控的机制研究
5.1 双敲除Cbl-b/c-Cbl会影响PU.1 对M-CSFR的转录调控
5.1.1 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四种小鼠的BMDM体外扩增
5.1.2 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四种小鼠的肺灌洗液中M-CSFR的表达情况
5.1.3 M-CSFR与Cbl-b/c-Cbl的相互作用
5.1.4 体外验证PU.1 与Cbl-b/c-Cbl的相互作用
5.2 双敲除Cbl-b/c-Cbl影响巨噬细胞中Lyn及其下游信号分子的表达
5.2.1 质谱法检测肺泡巨噬细胞中与Cbl-b/c-Cbl相互作用的分子
5.2.2 肺灌洗液以及BMDM中检测Lyn与SHIP1的表达
5.2.3 SHIP1与Cbl-b/c-Cbl相互作用
5.2.4 Lyn与Cbl-b/c-Cbl相互作用
5.2.5 抑制Lyn的表达会影响dKO小鼠BMDM中炎症因子及趋化因子受体的表达
5.2.6 Lyn下游信号分子的相关表达
5.2.7 小结
第六章 讨论
参考文献
综述 巨噬细胞在特发性肺纤维化中的作用机制及研究进展
参考文献
英文缩写
致谢
本文编号：3703040
【文章页数】：104 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 前言
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料
2.1.1 分子生物学试剂
2.1.2 细胞培养相关试剂及材料
2.1.3 抗体和细胞因子
2.1.4 小鼠
2.1.5 主要实验仪器
2.1.6 相关引物
2.2 实验方法
2.2.1.基因组DNA抽提与鉴定：（从小鼠尾巴中抽提全基因组DNA）
2.2.2.骨髓单个悬浮细胞的制备
2.2.3.BMDM的培养
2.2.4.细胞表面染色：用于流式分析
2.2.5 流式细胞分选
2.2.6.Western blot
2.2.7 免疫磁珠分选
2.2.8 RNA抽提
2.2.9 cDNA的制备
2.2.10 实时荧光定量PCR
2.2.11 质粒构建
2.2.12 胶回收
2.2.13 限制性酶切
2.2.14 感受态细菌的制备和质粒的转化
2.2.15 质粒DNA小量抽取
2.2.16 质粒DNA大量抽取
2.2.17 脂质体转染
2.2.18 免疫共沉淀
2.2.19 石蜡切片制备
2.2.20 苏木素-伊红(H&E)染色
2.2.21 天狼猩红染色
2.2.22 免疫荧光染色
2.2.23 刘氏染色法
2.2.24 银染
2.2.25 Brdu染色检测细胞增殖
2.2.26 Annexin V染色检测细胞凋亡
第三章 Cbl /c-Cbl在巨噬细胞中双敲除的小鼠模型的建立与鉴定
3.1 巨噬细胞活化后Cbl-b和c-Cbl的表达量升高
3.2 巨噬细胞中c-Cbl/Cbl-b双敲除小鼠模型的建立与鉴定
3.2.1 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的PCR鉴定
3.2.2 c-Cbl/Cbl-b敲除小鼠的Western blot鉴定
3.3 小结
第四章 Cbl-b/c-Cbl在巨噬细胞中双敲除小鼠的表型分析
4.1 Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠生存曲线
4.2 Cbl-b/c-Cbl双敲除小鼠肺损伤及其鉴定
4.3 双敲除小鼠肺灌洗液中肺泡巨噬细胞的表型分析
4.4 双敲除小鼠肺灌洗液中其他免疫细胞的表型分析
4.5 双敲除小鼠脾脏和胸腺中T细胞的表型分析
4.6 双敲除小鼠脾脏和骨髓中B细胞的表型分析
4.7 双敲除小鼠脾脏和骨髓中DC的表型分析
4.8 双敲除小鼠脾脏和骨髓中粒细胞的表型分析
4.9 双敲除小鼠脾脏和骨髓中巨噬细胞的表型分析
4.10 双敲除小鼠血液中单核细胞和粒细胞的表型分析
4.11 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞的活化
4.12 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞的增殖和凋亡
4.13 双敲除小鼠肺灌洗液中细胞因子及趋化因子受体的检测
4.14 双敲除小鼠肺泡巨噬细胞会诱导WT小鼠肺损伤
4.15 小结
第五章 Cbl-b/c-Cbl对巨噬细胞炎症调控的机制研究
5.1 双敲除Cbl-b/c-Cbl会影响PU.1 对M-CSFR的转录调控
5.1.1 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四种小鼠的BMDM体外扩增
5.1.2 WT、Cbl-b KO、c-Cbl KO和dKO四种小鼠的肺灌洗液中M-CSFR的表达情况
5.1.3 M-CSFR与Cbl-b/c-Cbl的相互作用
5.1.4 体外验证PU.1 与Cbl-b/c-Cbl的相互作用
5.2 双敲除Cbl-b/c-Cbl影响巨噬细胞中Lyn及其下游信号分子的表达
5.2.1 质谱法检测肺泡巨噬细胞中与Cbl-b/c-Cbl相互作用的分子
5.2.2 肺灌洗液以及BMDM中检测Lyn与SHIP1的表达
5.2.3 SHIP1与Cbl-b/c-Cbl相互作用
5.2.4 Lyn与Cbl-b/c-Cbl相互作用
5.2.5 抑制Lyn的表达会影响dKO小鼠BMDM中炎症因子及趋化因子受体的表达
5.2.6 Lyn下游信号分子的相关表达
5.2.7 小结
第六章 讨论
参考文献
综述 巨噬细胞在特发性肺纤维化中的作用机制及研究进展
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致谢
本文编号：3703040
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