基于CRISPR/Cas9技术的弓形虫rop16 I/III 缺陷虫株的构建及毒力鉴定

发布时间：2022-12-06 04:12

　　目的构建并鉴定弓形虫RH株rop16_I/III缺陷虫株。方法利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株。运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒。此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株。PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔrop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵。并比较RH株和RHΔrop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。结果经测序比对,成功构建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒。PCR鉴定结果显示,DHFR编码（编码乙胺嘧啶抗性... 

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞、载体和弓形虫株
        1.1.2 主要试剂与仪器
    1.2 方法
        1.2.1 Cas9质粒构建
        1.2.2 donor DNA质粒的构建
        1.2.3 电穿孔转染弓形虫速殖子及缺陷株弓形虫的筛选
        1.2.4 PCR鉴定PCR鉴定引物如下:
        1.2.5 蛋白质印迹实验(Western blotting)
        1.2.6 空斑实验(Plaque assays)
        1.2.7 吉姆萨染色观察弓形虫的增殖
        1.2.8 毒力试验
    1.3 统计学分析
2 结果
    2.1 靶点的设计与质粒突变
    2.2 donorDNA质粒的构建与donor DNA的扩增
    2.3 RHΔrop16虫株的PCR和Western blotting鉴定
    2.4 Plaque assays结晶紫染色后结果
    2.5 吉姆萨染色观察rop16基因缺陷弓形虫的增殖
    2.6 毒力试验
3 讨论



本文编号：3711037