重组人凝血因子Ⅶ在HEK293细胞中的瞬时表达

发布时间：2022-12-11 01:18

　　[目的]在HEK293细胞中表达人凝血因子Ⅶ（human coagulation factor,hFⅦ）蛋白。[方法]通过PCR分别扩增与hFⅦ羧基化有关的酶（γ-谷氨酰基羧化酶（GGCX）和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1（VKORC1））基因序列,与hFⅦ基因片段构建真核表达载体p CAEVKORC1-GGCX-hFⅦ,利用脂质体将表达载体转入HEK293细胞,采用Western blotting和ELISA方法检测细胞上清中hFⅦ的表达水平,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血活性。[结果]Western blotting检测细胞上清中含有hFⅦ蛋白,经ELISA检测表达量为12 mg/L,凝血因子Ⅶ检测试剂盒测定hFⅦ的促凝血相对比活性为612%。[结论]该表达载体成功在HEK293细胞中瞬时表达hFⅦ蛋白,为进一步深入研究hFⅦ的生物学特性奠定了基础。 

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 质粒菌株及细胞
    1.2 主要试剂及仪器
    1.3 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鉴定
    1.4 重组表达质粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的构建
    1.5 重组质粒转染细胞HEK293
    1.6 细胞培养上清中hFⅦ的Western blotting检测
    1.7 细胞培养上清中hFⅦ的ELISA检测
    1.8 细胞培养上清中hFⅦ的凝血活性分析
2 结果
    2.1 小鼠GGCX和VKORC1基因的克隆及鉴定
    2.2 重组质粒pCAE-VKORC-GGCX-hFⅦ的制备
        2.2.1 重组质粒pCAGGS-IRES-GGCX的鉴定
        2.2.2 重组质粒p CAGGS-VKORC1-IRES-GGCX的鉴定
        2.2.3 重组质粒pEE12.4-hFⅦ的鉴定
        2.2.4 重组质粒pCAE-VKORC1-GGCX-hFⅦ的鉴定
    2.3 重组人凝血因子Ⅶ蛋白的Western blotting鉴定
    2.4 ELISA检测细胞上清中的hFⅦ含量
    2.5 凝固法分析细胞培养上清中hFⅦ的凝血活性
3 讨论



本文编号：3717872