抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达

发布时间：2023-04-05 13:32

　　目的构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗。方法利用DNA重组技术,将激活细胞免疫和体液免疫的MPT64/Ag85B优势抗原基因和野生型katG基因编码区以及穿孔素/颗粒溶素整合进串联真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建抗结核重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1;电转化方法将质粒重组耻垢分枝杆菌制备菌苗;通过脂质体Lipofectamine 2000介导将重组质粒转染293T细胞。应用qRT-PCR技术在mRNA水平检测靶基因体外表达效果并用Western blot方法检测转染细胞是否表达目的蛋白。结果 PCR证实重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLYPRF1构建成功并制备重组耻垢分枝杆菌菌苗;qRT-PCR分析表明重组质粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRFl基因转染293T细胞后均有表达,免疫印迹分析重组质粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相对分子质量72 kDa处有明显蛋白表达条带,且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达;融合蛋白GNLY/PRF在相对分子质量75 kD...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞株、菌株和载体
        1.1.2 试剂与主要仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 质粒构建
        1.2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建
            1.2.2. 1 电转化
            1.2.2. 2 菌液PCR进行基因型鉴定
            1.2.2. 3 制备菌苗
        1.2.3 293T细胞转染
        1.2.4 Real-Time RT-PCR
        1.2.5 Western blot检测转染后蛋白表达
    1.3 统计学分析
2 结果
    2.1 质粒构建
    2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建
    2.3 质粒转染293T细胞结果效果分析
    2.4 质粒转染人源胚肾293T细胞中靶基因在mRNA水平上表达
    2.5 Western blot检测转染后蛋白表达情况
3 讨论



本文编号：3783502