钩端螺旋体M23金属内肽酶活性与致病性研究及流感嗜血杆菌OMP6优势抗原表位筛选与鉴定

发布时间：2023-09-18 19:53

　　第一部分钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶活性及致病性研究研究背景及意义:钩端螺旋体(以下简称钩体)病是由致病性钩体感染引起的自然疫源性人畜共患传染病,也是我国重点防疫和监控的主要传染病之一。根据致病性可将钩体分为致病性和非致病性两大类,问号钩体(Leptospira interrogans)是流行最广的致病性钩体基因种,我国则以问号钩体黄疸出血群赖型为优势流行的血清群型。致病性钩体具有强大的侵袭力,能迅速穿越皮肤和黏膜侵入人体,也能从血流中穿越血管壁扩散多种脏器和组织,但其侵袭力的物质基础及机制迄今未完全明了。金属蛋白酶(metalloprotease,MP)是一群能水解蛋白或多肽的酶类,问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组中具有多个产物注释为MP的基因,但其酶活性和致病作用尚无报道。研究方法:采用生物信息学软件分析问号钩体黄疸出血群赖型赖株LA2582和LA2901基因产物信号肽、跨膜区和功能结构域。构建LA2582和LA2901基因胞外区原核表达系统,采用Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rLA2582和rLA2901,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测其...

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致谢
中文摘要
    第一部分 钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶活性及致病性研究
    第二部分 不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势抗原表位筛选与鉴定
Abstract
    Part-Ⅰ Activity and pathogenicity of M23 superfamily metalloendopeptidases ofLeptospira interrogans
    Part-Ⅱ Screening and identification of predominant antigenic epitopes in OMP6 ofnontypeable Haemophilus influenzae
英文缩写词表
第一部分 钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶活性及致病性研究
    第1章 引言
        1.1 钩端螺旋体
        1.2 钩端螺旋体病
        1.3 细菌胞外金属蛋白酶
        1.4 研究内容及目的
            1.4.1 研究内容
            1.4.2 研究目的
        1.5 研究路线
    第2章 原核表达系统的构建及表达产物抗体的制备
        2.1 材料
            2.1.1 实验菌株
            2.1.2 实验质粒
            2.1.3 实验动物
            2.1.4 主要仪器及器材
            2.1.5 主要试剂
            2.1.6 主要试剂配制
        2.2 方法
            2.2.1 问号钩体LA2582和LA2901基因序列生物信息学分析
            2.2.2 问号钩体的培养
            2.2.3 问号钩体基因组DNA的提取
            2.2.4 目的基因的扩增和纯化
                2.2.4.1 引物设计
                2.2.4.2 目的基因的扩增
                2.2.4.3 PCR扩增片段的纯化
            2.2.5 T-A克隆
                2.2.5.1 大肠杆菌DH5a和BL21DE3感受态细胞的制备
                2.2.5.2 连接
                2.2.5.3 转化
                2.2.5.4 目的重组质粒的提取
                2.2.5.5 质粒pMD19-T^LA2582和pMD19-T^LA2901的双酶切鉴定
            2.2.6 LA2582和LA2901基因原核表达系统的构建及其重组蛋白的纯化
                2.2.6.1 目的基因片段的回收
                2.2.6.2 连接
                2.2.6.3 转化
                2.2.6.4 重组表达质粒的提取
                2.2.6.5 质粒pET-42a^LA2582和pET-42a^LA2901的双酶切鉴定
                2.2.6.6 重组蛋白的诱导表达
                2.2.6.7 SDS-PAGE电泳
                2.2.6.8 重组蛋白rLA2582和rLA2901的提取与纯化
                2.2.6.9 rLA2582-IgG和rLA2901-IgG制备
                2.2.6.10 免疫双向扩散法检测rLA2582-IgG和rLA2901-IgG效价
        2.3 结果
            2.3.1 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列跨膜预测结果
            2.3.2 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列信号肽预测结果
            2.3.3 问号钩体LA2582和LA2901基因氨基酸序列功能结构域预测结果
            2.3.4 PCR结果
            2.3.5 T-A克隆鉴定结果
            2.3.6 亚克隆鉴定结果
            2.3.7 LA2582和LA2901表达纯化结果及其抗血清效价
        2.4 小结
    第3章 钩端螺旋体M23金属内肽酶酶学活性研究
        3.1 材料
            3.1.1 主要试剂
        3.2 方法
            3.2.1 偶氮酪蛋白水解试验
            3.2.2 荧光五肽底物水解试验
            3.2.3 Km和Kcat值测定
            3.2.4 COL1和FN水解试验
            3.2.5 ELN水解试验
        3.3 结果
            3.3.1 水解活性及Km值和Kcat值
            3.3.2 水解COL1和FN活性
            3.3.3 ELN水解结果
        3.4 小结
    第4章 钩体感染细胞时基因mRNA、蛋白表达及外分泌检测
        4.1 材料
            4.1.1 实验菌株
            4.1.2 实验材料
            4.1.3 主要仪器设备
            4.1.4 主要试剂
            4.1.5 主要试剂配制
        4.2 方法
            4.2.1 HUVEC的培养
            4.2.2 RT-PCT引物
            4.2.3 建立钩体感染HUVEC模型
            4.2.4 问号钩体总RNA的提取
            4.2.5 反转录反应
            4.2.6 qRT-PCR
            4.2.7 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物表达水平变化
            4.2.8 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物外分泌检测
        4.3 结果
            4.3.1 qRT-PCR结果
            4.3.2 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物表达水平升高
            4.3.3 钩体感染HUVEC时LA2582和LA2901基因产物外分泌水平增加
        4.4 小结
    第5章 结果与讨论
    参考文献
第二部分 不可分型流感嗜血杆菌OMP6优势抗原表位筛选与鉴定
    第1章 引言
        1.1 研究背景
        1.2 研究内容
        1.3 研究目的
    第2章 TA克隆及基因序列与膜定位分析
        2.1 材料
            2.1.1 菌株来源及其培养
            2.1.2 主要试剂与仪器
        2.2 方法
            2.2.1 NTHi临床菌株及ATCC49247株基因组DNA的提取
            2.2.2 omp6基因扩增及其产物测序
            2.2.3 omp6基因序列和膜定位分析
        2.3 结果
            2.3.1 omp6基因检测和分析结果
            2.3.2 OMP6膜定位分析结果
        2.4 小结
    第3章 T-B联合抗原表位预测及其序列的扩增、克隆与鉴定
        3.1 实验材料
            3.1.1 主要实验试剂
        3.2 方法
            3.2.1 T-B联合抗原表位预测
            3.2.2 T-B联合抗原表位肽序列扩增、克隆和鉴定
        3.3 结果
            3.3.1 T-B联合抗原表位预测结果
            3.3.2 T-B联合表位肽编码序列扩增和测序结果
        3.4 小结
    第4章 OMP6 M13KE展示肽系统的构建及其免疫反应性与抗原性检测
        4.1 材料
            4.1.1 实验试剂
            4.1.2 实验仪器
        4.2 方法
            4.2.1 M13KE展示肽系统构建及鉴定
            4.2.2 重组噬菌体扩增和提取
            4.2.3 免疫反应性检测
            4.2.4 抗原性检测
        4.3 结果
            4.3.1 免疫印迹法检测结果
            4.3.2 ELISA检测结果
        4.4 小结
    第5章 结论
    参考文献
综述
    参考文献
作者简历与攻读学位期间取得的科研成果



本文编号：3848178