基于萤火虫荧光素酶的凋亡检测方法的建立及其在筛选结核分枝杆菌蛋白调控细胞凋亡中的应用

发布时间：2023-11-20 19:23

　　结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)简称结核杆菌,是结核病的病原菌,目前世界上约1/3的人口感染结核分枝杆菌,其中5%-10%的感染者将发展成为活动性结核病,全球每年新增结核病患者约880万,死亡约300万。细胞凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,在组织分化、器官发育、机体稳态等生理过程中发挥着重要作用。尽管细胞凋亡是一种正常的生理现象,但是异常的细胞凋亡常引起许多疾病。调节宿主细胞凋亡是结核分枝杆菌致病性的一部分,影响结核分枝杆菌的生存、繁殖、扩散等过程。快速准确的检测细胞凋亡是研究凋亡相关机制以及评价凋亡对疾病过程影响的基础。Caspase-3的激活是细胞凋亡的重要标志,常被应用于凋亡检测方法的建立。为了方便快速的检测结核分枝杆菌蛋白对细胞凋亡的影响,本研究将caspase-3的识别序列与萤火虫荧光素酶融合表达构建了一个新型的caspase-3报告质粒,用于细胞凋亡的检测,并筛选了部分结核分枝杆菌编码的蛋白,具体研究内容如下:1.Caspase-3报告质粒的构建及验证本研究构建了四种caspase-3报告质粒,将四种报告质粒分别转染He La细胞,在细胞...

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摘要
ABSTRACT
缩略语表（ABBREVIATION）
第1章 文献综述
    1.1 细胞凋亡简介
    1.2 细胞凋亡特征
        1.2.1 细胞凋亡形态学特征
        1.2.2 DNA片段化
        1.2.3 组织谷氨酰胺转移酶活化
    1.3 细胞凋亡信号通路
        1.3.1 死亡受体通路
        1.3.2 线粒体通路
        1.3.3 内质网通路
    1.4 细胞凋亡检测方法
        1.4.1 形态学观察
        1.4.2 DNA片段化检测
        1.4.3 磷脂酰丝氨酸定位检测
        1.4.4 凋亡相关基因检测
        1.4.5 新型细胞凋亡检测方法
    1.5 结核分枝杆菌与细胞凋亡
        1.5.1 抑制细胞凋亡
        1.5.2 促进细胞凋亡
        1.5.3 ESAT-6 家族蛋白与细胞凋亡
第2章 目的与意义
第3章 材料与方法
    3.1 试验材料
        3.1.1 细胞与菌株
        3.1.2 引物、载体
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 培养基和抗生素的配制
        3.1.5 主要缓冲液和试剂及其配制
        3.1.6 主要实验仪器及设备
        3.1.7 分子生物学分析软件
        3.1.8 统计学方法
    3.2 试验方法
        3.2.1 报告质粒的构建
        3.2.2 ESAT-6 家族蛋白真核表达质粒的构建
        3.2.3 酶切产物回收与纯化
        3.2.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
        3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
        3.2.6 连接产物的转化
        3.2.7 质粒的制备与鉴定
        3.2.8 质粒转染（脂质体介导转染法）
        3.2.9 双荧光素酶检测实验
        3.2.10 细胞凋亡检测
        3.2.11 实时荧光定量PCR
        3.2.12 Western Blot样品准备
第4章 结果与分析
    4.1 Caspase-3 报告质粒的构建
    4.2 Caspase-3 报告质粒的验证
    4.3 结核分枝杆菌ESAT-6 家族蛋白的筛选
    4.4 筛选结果的验证
    4.5 核因子-kB（NF-kB）参与esxT诱导的细胞凋亡
第5章 讨论与结论
    5.1 讨论
        5.1.1 Npu DnaE内含肽的选择
        5.1.2 真核表达的选择
        5.1.3 促进TNF-α 诱导细胞凋亡的筛选
        5.1.4 结核分枝杆菌ESAT-6 家族蛋白的筛选及验证
    5.2 结论
参考文献
致谢
附录



本文编号：3865684