抗VEGF抗体片段Fab在大肠杆菌中的高效分泌表达

发布时间：2023-11-25 18:58

　　目前,抗体片段Fab在治疗人类多种疾病(如癌症、病毒感染、炎症等)方面起着重要作用。由于其缺少糖基化的Fc区,因此并不需要进行糖基化修饰。此结构特点使得Fab可在大肠杆菌中进行活性表达。Escherichia coli作为宿主菌株的突出优势在于低成本、生长快、易控制,在短时间内可以获得高产量,因此,已逐渐成为生产抗体的中坚力量。但是,在E.coli中生产抗体片段Fab的主要限制因素在于Fab的产量较低,原因主要是Fab易在胞质中错误折叠、聚集,形成无生物学活性的包涵体,且宿主菌中含有多种蛋白酶,对Fab有一定的降解作用等。因此,为提高抗体产量,可以从表达载体、宿主菌株、分子伴侣及折叠酶等几个方面着手,以期达到理想目标。本课题从三方面对Fab的表达进行了优化:1)在实验室前期工作基础上,以E.coli DH11 T7为宿主菌株,通过构建不同的Fab表达载体,最终提高Fab在E.coli中的产量;2)在1)工作的基础上,通过共表达多种分子伴侣,进一步提高Fab在E.coli中的产量;3)在E.coli周质蛋白酶缺陷菌株DHll-ptr-degp(以下简称86D)的基础上,对其基因组上spr...

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词说明
前言
    1.小分子抗体在大肠杆菌中的表达
    2.小分子抗体在大肠杆菌中分泌表达的研究进展
    3.本课题研究内容
第一章 抗VEGF抗体Fab片段表达载体构建及信号肽优化
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和质粒
        1.1.2 引物
        1.1.3 培养基及溶液
        1.1.4 试剂
        1.1.5 分子量标志物
        1.1.6 工具酶
        1.1.7 试剂盒
        1.1.8 生物信息学软件
        1.1.9 统计学分析
        1.1.10 主要仪器和设备
    1.2 方法
        1.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收
        1.2.2 质粒的提取
        1.2.3 化学感受态细胞的制备与化学转化法
            1.2.3.1 化学感受态细胞的制备(参照《分子克隆实验指南第三版》)
            1.2.3.2 化学转化法
        1.2.4 构建信号肽突变体
        1.2.5 构建Fab表达载体
        1.2.6 不同表达菌株生长曲线的测定
        1.2.7 全菌蛋白的SDS-PAGE分析及Western Blot
        1.2.8 Fab含量测定及分析
        1.2.9 Protein L亲和层析柱纯化抗体片段Fab
        1.2.10 抗体蛋白Fab浓度的测定
            1.2.10.1 BCA试剂盒测蛋白浓度
            1.2.10.2 依据CurveExpert软件绘制标准曲线
    1.3 结果
        1.3.1 Fab表达载体的构建
        1.3.2 Fab表达载体的筛选
        1.3.3 DsbA及STII系列表达Fab载体的构建
        1.3.4 DsbA及STII系列表达Fab载体的筛选
        1.3.5 抗VEGF-Fab的蛋白制备
    1.4 讨论
第二章 分子伴侣表达载体的筛选
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 培养基及溶液
        2.1.4 试剂
        2.1.5 分子量标志物
        2.1.6 工具酶
        2.1.7 试剂盒
        2.1.8 生物信息学软件
        2.1.9 统计学分析
        2.1.10 主要仪器和设备
    2.2 方法
        2.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收
        2.2.2 质粒的提取
        2.2.3 大肠杆菌基因组的提取
        2.2.4 化学感受态细胞的制备与化学转化法
        2.2.5 构建分子伴侣表达载体
        2.2.6 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中的筛选
            2.2.6.1 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中的菌株生长特征
            2.2.6.2 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中Fab的表达差异
    2.3 结果
        2.3.1 分子伴侣表达载体的构建
        2.3.2 分子伴侣表达载体的筛选
    2.4 讨论
第三章 蛋白酶缺陷菌株的构建及发酵工艺
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 培养基及溶液
        3.1.4 试剂
        3.1.5 分子量标志物
        3.1.6 工具酶
        3.1.7 试剂盒
        3.1.8 生物信息学软件
        3.1.9 统计学分析
        3.1.10 主要仪器和设备
    3.2 方法
        3.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收
        3.2.2 质粒的提取
        3.2.3 大肠杆菌基因组的提取
        3.2.4 化学感受态细胞的制备与化学转化法
        3.2.5 spr点突变菌株的构建
            3.2.5.1 供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB的构建
            3.2.5.2 利用供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB实现spr点突变
        3.2.6 发酵培养基配方确定
        3.2.7 起始培养基中葡萄糖浓度的筛选
        3.2.8 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺
        3.2.9 不同蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺
    3.3 结果
        3.3.1 构建spr基因突变的蛋白酶缺陷菌株
            3.3.1.1 供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB的构建
            3.3.1.2 Cm抗性基因整合鉴定
            3.3.1.3 spr点突变菌株鉴定
        3.3.2 发酵培养基摇瓶筛选
        3.3.3 起始培养基中初始葡萄糖浓度的确定
        3.3.4 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺
        3.3.5 不同蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺
    3.4 讨论
总结与展望
参考文献
附录一: 引物序列
附录二: 信号肽序列
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果



本文编号：3867665