肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因结构域缺失株的构建及功能研究

发布时间：2017-06-02 03:02

  本文关键词：肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因结构域缺失株的构建及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)是大肠埃希菌的一个亚型,有100余种血清型,其中0157：H7是EHEC中引起危害最大的病原菌。EHEC O157:H7通过粪-口途径传播,主要寄居于牛、羊等反刍动物体内,是一种食源性人畜共患肠道致病菌。同其他EHEC血清型主要引起感染性腹泻不同,EHEC O157:H7能够引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒综合症(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic purpura, TTP)等疾病。1982年,美国学者Riley等首次在严重出血性腹泻患者粪便中分离出EHEC O157:H7。此后,世界范围内不断有EHEC O157:H7引起的散发病例和小型暴发。1996年5-8月,日本大阪Sakai市发生了一起涉及40余县市的EHEC O157:H7暴发流行,累计感染者9000余名,造成11人死亡。2000年,加拿大Ontario市Walkerton区发生一起EHEC O157:H7暴发,累计患者5000余名,造成5人死亡,据报道,暴发是由Walkerton区供水系统受污染引起。1986年,我国首次从出血性结肠炎患者中分离到EHEC O157:H7,此后全国多地有小规模爆发流行。1999-2000年,我国苏皖等地发生了一起大规模EHEC O157:H7暴发流行,患者约2万余人,死亡177人,流行长达7个月,可能是迄今为止EHEC O157:H7世界范围内流行规模最大、死亡人数最多、流行时间最长、发病原因最复杂的一次。目前,EHEC O157:H7的暴发流行仍时有发生,总体流行呈上升趋势,且具有较强的致病性和致死性,对人类健康构成极大威胁,是全球性的公共卫生问题。EHEC O157:H7的致病作用主要体现在两方面：分泌志贺样毒素(Shiga toxin, Stx)和细菌对肠黏膜上皮细胞造成黏附-抹去损伤(Attaching and effacing Lesion, A/E损伤)。EHEC O157:H7分泌的志贺样毒素分Stx1和Stx2两型,可导致Vero细胞病变,因此也称Vero毒素。EHEC O157:H7细菌进入人体肠道后,紧密黏附于肠黏膜上皮细胞,使肠黏膜上皮细胞骨架重排、细胞间紧密连接破坏、肠微绒毛肌动蛋白去聚化,导致微绒毛收缩和脱落,造成A/E损伤。引起A/E损伤的主要毒力基因位于EHEC染色体肠细胞脱落位点(Locus of enterocyte effacement, LEE)毒力岛,LEE毒力岛由LEE1-LEE5五个操纵子组成,编码多种重要毒力因子。EspF基因位于LEE4末端,编码分泌效应蛋白EspF (EHEC-secreted protein F),其在分泌效应蛋白中作用范围最广、功能最多。关于致病型大肠埃希菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)的研究表明,细菌通过Ⅲ型分泌系统(Type three secretion system, TTSS)将EspF蛋白注射至肠黏膜上皮细胞细胞内后,EspF蛋白可与宿主细胞内多种蛋白分子作用,造成宿主细胞核仁、线粒体、中间丝状体破坏,微绒毛抹去,细胞间紧密连接破坏,细胞膜重建,细胞骨架重排,垫状结构(Pedestal formation)形成,最终导致细胞凋亡。EspF蛋白与A/E损伤致病菌的致病机制密切相关,学术界称EspF为A/E损伤致病菌致病作用的“瑞士军刀”经生物信息学分析,EHEC 0157:H7 EspF蛋白N端(1-73aa)包含一个分泌信号(1-20aa)、一个宿主细胞线粒体结合信号区域(Mitochondrial targeting signal, MTS, 1-24aa),一个核仁结合域(Nucleolar targeting domain, NTD,21-74aa)。C端(73-248aa)由4个PRR组成,各个PRR之间高度同源,各自包含一个真核细胞SNX9 (Sorting nexin 9)蛋白结合位点SH3(Srchomology3)基序,一个N-WASP (Neuronal Wiskott-aldrich syndrome protein)结合域,一个可能的肌动蛋白结合基序(Actin binding motif, ABM)EHEC O157:H7 EspF蛋白N端的MTS位点能够靶向结合宿主细胞线粒体,研究表明,如果将MTS的第16位亮氨酸突变为谷氨酸,EspF蛋白不能结合到线粒体,用自杀质粒将N端包括MTS位点的部分基因敲除后,细菌对细胞的黏附能力和介导细胞凋亡能力下降。C端4个PRR均含有SH3结合基序PxxP,能特异结合宿主细胞含SH3结合域的蛋白,如SNX9蛋白,其含有三个保守区域SH3、PX和BAR,SH3由50-60个氨基酸组成,主要识别富含脯氨酸序列PxxP模块的细胞信号蛋白(如Src和Abl酪氨酸激酶蛋白家族),介导蛋白-蛋白的相互作用。SNX9蛋白是一个细胞内膜调控子,可引起膜小管形成,诱导细胞膜重建,促进细菌的侵袭。目前,国内外对EPEC的EspF蛋白功能进行了较为深入的研究,但对EHEC的EspF蛋白功能研究较少,其与肠上皮细胞内蛋白相互作用、诱导肠上皮细胞凋亡的机制以及EspF蛋白各个功能域的作用仍不明确。本课题组在前期工作中构建了EHEC O157:H7espF基因N端缺失株,证明大肠杆菌0157：H7EspF蛋白N端能靶向结合线粒体,诱导细胞凋亡。而EspF蛋白C端PRR区能与宿主细胞中SNX9等蛋白通过其SH3结合域结合,在细胞内形成了一个复杂而庞大的蛋白与蛋白相互作用网络,并与细胞信号传导通路和细胞凋亡存在某种联系。那么这些蛋白是怎样协同作用启动或介导了细胞凋亡呢?是否与出血性肠炎有关呢?仍有待于进一步研究。根据EspF蛋白的结构研究,本研究从EspF的N端结构域与C端PRR结构域入手,利用λ Red重组系统构建了3株EHEC O157:H7 EDL933w菌株的基因缺失株：espF基因缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w △espF)、espF基因N端缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w △espF-N)和espF基因C端缺失株(EHEC O157:H7 EDL933w AespF-C),同时构建各自的回补株,研究比较野生株、缺失株与回补株的生物学差异、对宿主细胞的黏附力差异及诱导细胞凋亡的能力差异,初步研究了各功能域对细菌毒力的影响及相关功能。二、研究方法1、EHEC O157:H7 espF基因结构域缺失株与回补株的构建(1)缺失株的构建根据GenBank的espF基因序歹(Accession NO. NC_02655)及其上、下游的DNA序列,设计合成两对含同源臂引物:H1K1、H2K2和H3K3、H4K4。H1K1与H2K2用于构建espF基因敲除株打靶片段,H3K3与H2K2用于构建espF基因N端敲除株打靶片段,H1K1与H4K4用于构建espF基因C端敲除株打靶片段。这4条引物5’端为与待敲除区域基因上下游50bp同源的同源臂,用于扩增打靶片段两端的同源臂,3’端与卡那霉素抗性基因部分序列同源,用于扩增打靶片段中央的卡那霉素抗性基因。以含卡那霉素抗性基因的质粒pKD4为模板,分别以H1K1与H2K2、H3K3与H2K2、H1K1与H4K4为引物PCR扩增,得到espF基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-N基因卡那霉素抗性打靶片段、espF-C基因卡那霉素抗性打靶片段。将打靶片段电击转化进入含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w菌株中,利用L-阿拉伯糖诱导pKD46质粒表达重组酶,利用λRed同源重组系统,卡那霉素抗性片段的卡那霉素抗性基因替换待敲除的espF、espF-N、espF-C基因。利用卡那霉素筛选出阳性重组菌,设计两对引物F1、R2和F2、R1,其中F1、R2位于espF基因上下游,F2、R1位于卡那霉素抗性基因上,通过交叉引物PCR及测序,验证阳性菌是否发生了同源重组。(2)回补株的构建根据GenBank的espF基因序列(Accession NO. NC_02655)设计两对引物：Fc、Rn和Fn、Re。引物Fc与Rn扩增espF基因片段,引物Fn与Rn扩增espF-N基因片段,引物Fc与Rc扩增espF-C端基因片段。将PCR扩增片段切胶纯化,与载体pGEM-T easy进行连接反应后,转化于大肠杆菌DH5α,利用氨苄霉素筛选阳性菌,PCR并测序,得到完成连接的DH5 α pGEM-espF、 DH5α pGEM-espF-N, DH5α PGEM-espF-C菌株。培养提取质粒后分别电击转化转入相应基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C.氨苄霉素筛选阳性菌,提取质粒,以Fc、Fn、Rc、Rn为引物PCR并测序验证回补质粒已转入缺失株,成功构建回补株。2、野生株与突变株生物学特征的比较野生株和突变株经涂片-干燥-固定后进行革兰染色：初染-媒染-脱色-复染,光学显微镜观察。在相同培养条件下,在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20 h分别测定野生株和突变株的OD600值,以时间为横坐标,OD600的对数值为纵坐标,绘制各菌株的生长曲线。3、细菌黏附实验(1)吉姆萨(Giemsa)染色观察细菌黏附结肠癌细胞Lovo于6孔板培养至单层后,分别用相同浓度EHEC O157:H7野生株和突变株感染细胞2小时,按吉姆萨染色步骤处理：涂片-固定-染色-洗脱。在光学显微镜下观察野生株和突变株对Lovo细胞的黏附情况。(2)涂板计算细菌黏附率过夜培养的野生株、espF缺失株(△espF)、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株(△espF-C)、和阴性对照菌(DH5α)共5株,重悬于不含抗生素的培养基(DMEM,10%胎牛血清),重悬后细菌的浓度均为2×107/mL。 Lovo细胞培养于12孔板内,长至单层细胞(约2×105　cells/孔)。以每孔2×107的细菌量接种到培养Lovo细胞的12孔板内(细胞感染倍数100：1),轻轻晃动培养板混匀。细胞培养板放入培养箱,37℃,5%C02,培养1.5-2h。每种细菌接种4个复孔。培养后细胞用PBS洗3次,加入150μl的0.5%　Triton X-100裂解细胞,孵育8min后,加入100μl　PBS,反复吹打吸出样品,每孔样品分别10-2、10-3、10-4梯度稀释后涂布于同一块琼脂平板上均匀分布的三区中,每区加稀释后的菌液20uL,轻柔地对平板进行倾斜旋转,使得各区菌液面积均匀扩大但不得超过分区的划线。24小时后进行菌落计数,计算黏附率(黏附率=黏附到细胞的细菌数/初始加到细胞孔的总细菌数×1000‰)。用SPSs13.0软件进行单因素方差分析(One Way ANOVA),比较各菌株黏附率平均值的差异。三、结果1、构建了三株EHEC O157:H7 EDL933w espF基因缺失株：espF基因缺失株(△espF)、N端缺失株(△espF-N)、C端缺失株(△espF-C),并构建了各自的基因回补株用引物H1-K1与H2-K2、H3K3与H2K2、H1K1与H4K4,分别PCR扩增出卡那霉素抗性打靶片段,大小为1576bp,分别电击转化于含有质粒pKD46的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细胞中。用含kana的LB固体培养基筛选得到阳性菌,增菌后,用卡那霉素基因内部鉴定引物PCR电泳验证,发现野生株中无目的条带,缺失株中可见到一条大小为471bp的片段。测序证实,菌株EHEC O157:H7 espF基因(747bp)、espF-N基因(219)和espF-C基因(528)完全缺失。用引物Fc与Rn、Fn与Rn、Fc与Rc,分别PCR扩增出回补片段,大小分别为747bp、219bp、528bp,经琼脂糖电泳,切胶纯化回收后,与载体pGEM-T easy于4℃连接12h后转化入感受态细胞DH5 α中,用氨苄霉素LB固体培养基筛选阳性菌,将筛选到的阳性菌提取质粒后用通用引物M13 PCR并测序。根据测序结果确定含有正确重组载体的阳性菌,将其扩大培养后提取质粒,分别电击转化入相应的基因缺失株△espF、△espF-N、△espF-C,成功构建了基因回补株。2、野生株与缺失株生物学特征比较结果经革兰染色可见,野生株和三株突变株均为革兰染色阴性,短小棒状杆菌。根据所测的OD600绘制生长曲线,野生株和突变株的生长曲线趋势基本一致。3、细菌黏附实验吉姆萨染色可见野生株黏附于细胞的数量较多,突变株较少,黏附数：野生株多于突变株多于DH5 α。涂板后计数菌落,计算细菌的黏附率,数据经单因素方差分析,结果显示,野生株与突变株间的黏附率比较P0.01,具有统计学意义。野生株的平均黏附率是13.879±3.578‰,突变株△espF的平均黏附率是6.401±1.519‰,突变株△espF-N的平均黏附率是5.402±3.212‰,突变株△espF-C的平均黏附率是4.795±1.950‰,DH5 α平均黏附率是0。四、结论1.利用λRed同源重组系统,成功构建了EHEC 0157:H7 EDL933w espF缺失株(△espF).N端缺失株(△espF-N.)和C端缺失株(△espF-C),并成功构建了espF基因回补株、N端回补株和C端回补株。为今后EHEC 0157:H7 EspF蛋白的功能研究打下了基础。2.espF基因及结构域基因的缺失不影响EHEC 0157:H7的形态与生长规律。3espF基因及结构域基因的缺失降低了EHEC 0157:H7对肠黏膜上皮细胞的黏附力,黏附力：野生株高于突变株,突变株高于DH5α。
【关键词】：肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因 λRed同源重组系统 黏附-抹去 (A/E)损伤
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 1 肠出血型大肠埃希菌O157:H7的流行病学17-18
• 2 肠出血型大肠埃希菌O157:H7的致病机制18-20
• 3 分泌蛋白EspF的结构与功能20-23
• 4 EspF研究中的问题与本论文研究宗旨23-25
• 第一章 EHEC O157:H7 espF基因结构域缺失株与回补株的构建25-45
• 1.1 材料25-28
• 1.2 方法28-37
• 1.3 结果37-43
• 1.4 讨论43-45
• 第二章 EHEC O157:H7基因缺失株生物学特性初步研究45-54
• 2.1 材料45-46
• 2.2 方法46-48
• 2.3 结果48-52
• 2.4 讨论52-54
• 全文总结54-57
• 参考文献57-63
• 附录 英文缩略词表63-64
• 硕士期间完成的论文64-65
• 致谢65-66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陆献耀;陆群英;占利;余樟有;金莞尔;尹志英;杨瑞军;;浙江省衢州市柯城区检出带毒力基因的肠出血性大肠埃希菌O157:H7[J];疾病监测;2008年10期

2 倪大新,汪华,顾玲,郭喜玲,庄菱,施平,潘浩,史智扬,胡晓抒,刘光中;江苏省1999年大肠埃希菌O157∶H7宿主动物带菌情况调查[J];中华流行病学杂志;2002年02期

3 肖成蕊,刘和平,王振国,王伟利,魏柏友,张辉;吉林省鸡肉中O-157:H7埃希氏大肠杆菌的检出状况[J];中国动物检疫;2004年04期

  本文关键词：肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因结构域缺失株的构建及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：414061