过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究

发布时间：2017-06-04 09:00

  本文关键词：过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：刚地弓形虫病是一种在全球内普遍流行的人兽共患寄生虫病。不仅对孕妇和胎儿构成了极大的威胁,近年来又成为AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形虫药物大部分都存在长期治疗效果差、难根治、高费用且对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等诸多缺点,研发新型治疗弓形虫病药物很有必要。药物研究依赖于高效稳定的弓形虫体内和体外培养模型,建立弓形虫培养模型不仅可用于筛选新型抗弓形虫药物,还可用于抗弓形虫药物的作用机理研究。过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)对细胞的活力和增殖力均具有抑制和/或杀伤作用,然而有关H2O2能否诱导弓形虫凋亡的作用机制仍然不清楚。近年来,不少数据表明,H2O2可以诱导众多细胞凋亡,本文以H2O2是否能诱导弓形虫速殖子凋亡作探讨,旨在进一步阐明H2O2诱导弓形虫RH株凋亡的机制,为弓形虫病的免疫预防和临床治疗新方案的设计提供理论和实验依据。复苏刚地弓形虫RH株速殖子,注射接种小鼠腹腔;建立虫体与小鼠巨噬细胞(RAW264.7)细胞的共同培养体系,依次以不同比例的虫体接种细胞,观察虫体在细胞内的增殖情况,确定适宜的虫体与细胞感染比例及培养时间。以滤膜过滤法纯化体内培养和体外培养模型获得速殖子。采用吉姆萨染色、琼脂糖凝胶电泳、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)、流式细胞技术测定DNA含量检测H2O2处理弓形虫速殖子凋亡的特征;检测凋亡过程中胞内钙离子浓度变化。RH株速殖子可在RAW264.7细胞内增殖,接种72h后细胞能完全被破坏释放出大量虫体,虫体在细胞内增殖速度和传代间隔稳定、形态典型,未见毒力明显减弱。两种滤膜对体内白细胞清除率无明显差异,对红细胞清除效果随滤膜孔径增大依次降低,小鼠体内速殖子的回收率随着孔径增大依次升高。两种滤膜对RAW264.7细胞的清除率无明显差异,体外培养的速殖子的回收率随着滤膜孔径增大而升高,并且两者间差异有统计学意义。光镜下观察H2O2处理弓形虫后,虫体失去典型形态,活力明显下降。琼脂糖凝胶电泳测定H2O2处理速殖子后的DNA未见片段化条带,以流式细胞仪检测H2O2处理速殖子凋亡程度,发现存在凋亡,随时间增大其凋亡程度扩大。流式细胞仪分析速殖子以H2O2处理后DNA含量的变化,发现H2O2组速殖子数少,DNA含量降低。测定H2O2处理速殖子过程中胞浆钙离子浓度随着时间增长以及处理浓度增高而增高。成功建立刚地弓形虫RH株速殖子体外培养模型。初步研究发现H2O2能诱导弓形虫速殖子凋亡及其过程中胞浆钙离子浓度升高。
【关键词】：弓形虫 凋亡 过氧化氢
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要内容中英文缩写11-13
• 第1章 绪论13-19
• 第2章 实验材料19-25
• 2.1 主要仪器19-20
• 2.2 虫体，小鼠及细胞株20
• 2.3 主要试剂盒20
• 2.4 主要试剂20-21
• 2.5 试剂配制21-22
• 2.6 生物信息学软件22-23
• 2.7 其它23-25
• 第3章 实验方法25-33
• 3.1 弓形虫速殖子培养模型的建立25-28
• 3.1.1 速殖子的复苏以及传种25
• 3.1.2 速殖子小鼠体内的传代25-26
• 3.1.3 速殖子液氮保种26
• 3.1.4 RAW264.7 细胞系复苏、传代及保种26-27
• 3.1.5 弓形虫速殖子毒力的检测27
• 3.1.6 在 RAW264.7细胞内弓形虫速殖子连续传代保种27-28
• 3.2 弓形虫速殖子的纯化28-29
• 3.3 过氧化氢诱导弓形虫凋亡检测29-31
• 3.3.1 DNA琼脂糖凝胶电泳29
• 3.3.2 弓形虫速殖子凋亡吉姆萨染色形态学观察29-30
• 3.3.3 流式细胞术检测弓形虫速殖子凋亡率30
• 3.3.4 弓形虫速殖子DNA含量的测定30
• 3.3.5 凋亡过程中胞浆游离钙浓度的测定30-31
• 3.4 统计分析31-33
• 第4章 实验结果33-43
• 4.1 弓形虫速殖子的体内培养及毒力检测33
• 4.2 弓形虫速殖子的体外培养及毒力检测33-34
• 4.3 两种孔径滤膜纯化速殖子结果比较34-35
• 4.4 弓形虫速殖子凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳35-36
• 4.5 弓形虫速殖子凋亡的吉姆萨染色36-37
• 4.6 H_2O_2对弓形虫速殖子凋亡程度的时间影响37-38
• 4.7 H_2O_2对弓形虫凋亡过程中DNA含量的变化38-40
• 4.8 H_2O_2诱导速殖子凋亡过程中游离钙变化40-43
• 第5章 讨论43-49
• 第6章 结论49-51
• 参考文献51-57
• 综述57-63
• 参考文献61-63
• 作者攻读学位期间的科研成果63-65
• 本研究受以下基金资助65-67
• 致谢67

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本文编号：420477