EGCG-p抗EV71病毒的分子作用机理

发布时间：2017-06-04 23:17

  本文关键词：EGCG-p抗EV71病毒的分子作用机理，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：EV71肠道病毒是导致手足口病的最主要病毒。每年有数百万儿童遭受手足口病困扰,可是现今并没有有效的治疗药物。EGCG是一种天然的抗病毒药物,已经被证明有多种病毒的抗病毒效果。EGCG具有抗多种病毒的功效,而且其成分来源于茶叶,毒副作用小对发展新药拥有巨大的潜力。EGCG在水中不稳定,而且容易氧化导致损失。为此,我们用的是已经被证明具有抗病毒活性的经过修饰的脂溶性的EGCG-p(结合了脂肪酸棕榈酸酯Palmitate), EGCG-p提高了化合物的稳定性。到目前为止,鲜有人对EGCG-p抗EV71病毒进行研究,EGCG-p抗EV71病毒仍然是一个未知领域,为了验证EGCG-p具有抗EV71病毒的有效性,本文对EGCG-p体外抗EV71病毒进行初步研究,旨在为进一步的开发临床应用提供理论基础和实验依据。EV71在人横纹肌瘤细胞(RD细胞)中的增殖活动比其他细胞活跃,增殖效率比其他细胞高,因此选取RD细胞作为细胞基质进行体外实验。我们用三种不同方法(先加药物后加病毒；先加病毒后加药物；病毒与药物同时添加)研究EGCG-p抗EV71病毒效果,我们先对EV71病毒进行毒力测试,测得病毒毒力后再运用不同添加病毒与药物的次序方法进行实验,当细胞发生明显病变后运用氯仿抽提RNA法进行RNA抽提,然后逆转录以获得EV71病毒cDNA,最后对其进行荧光定量PCR检测,结果显示先加药物后加病毒具有显著效果。据此,我们认为EGCG-p具有预防EV71病毒的效果。为了进一步研究EGCG-p抗EV71病毒的分子作用机理,本研究克隆表达了SCARB2受体蛋白与EV71病毒蛋白VP1,通过分子相互作用仪对SCARB2、EGCG-p与VP1进行相互作用。SCARB2受体与VP1进行测试,结果显示SCARB2受体与VP1相互作用的亲和力平均值是0.045μM,Full R2是0.96,说明软件拟合计算可信度比较高。然后我们再对SCARB2受体与EGCG-p进行相互作用,计算出SCARB2受体与EGCG-p相互作用的亲和力平均值是0.0176μM,Full R2是0.95,说明软件拟合计算可信度比较高。最后对SCARB2+EGCG-p与VP1的进行相互作用。比较SCARB2受体与VP1相互作用的亲和力平均值是0.045μM。SCARB2+EGCG-p与VP1相互作用的亲和力平均值是0.549μM,FullR2是0.925。得出在EGCG-p存在下,SCARB2与VP1的亲和力降低了,从分子水平上说明EGCG-p具有抗病毒作用。从这些实验结果可得出EGCG-p能与受体蛋白SCARB2结合,阻止了EV71病毒的入侵,从分子水平上证明了EGCG-p能起到抗病毒作用,起到预防效果。
【关键词】：EGCG-p EV71 SCARB2 VP1 抗病毒 分子作用机理
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 研究背景8-15
• 1.1 手足口病8
• 1.2 病毒8-9
• 1.3 病毒侵入细胞的机理9-10
• 1.4 EV71肠道病毒10
• 1.5 人肠道病毒EV71受体10-12
• 1.6 EGCG12
• 1.7 EV71药物的研究进展及其意义12-13
• 1.8 本研究目的、意义及其技术路线13-15
• 第二章 EGCG-p的抗病毒效果15-23
• 2.1 实验材料15
• 2.1.1 主要仪器及试剂15
• 2.1.2 溶液配置15
• 2.2 实验方法15-18
• 2.2.1 细胞毒性试验15-16
• 2.2.2 EV71病毒对细胞半数感染量(TCID50)测定16
• 2.2.3 细胞和病毒的培养16
• 2.2.4 RNA的提取16
• 2.2.5 逆转录以获得EV71病毒cDNA16-17
• 2.2.6 荧光定量PCR检测EV71 mRNA17-18
• 2.3 结果18-22
• 2.3.1 细胞毒性试验分析18-19
• 2.3.2 EV71病毒滴度19
• 2.3.3 EGCG-p的抗病毒效果19-22
• 2.4 讨论22-23
• 第三章 目的蛋白的表达与纯化23-31
• 3.1 实验材料23-24
• 3.1.1 主要仪器及试剂23
• 3.1.2 溶液配置23-24
• 3.2 实验方法24-31
• 3.2.1 目的基因SCARB2的扩增24-25
• 3.2.1.1 人RD细胞总RNA的提取24
• 3.2.1.2 逆转录以获得cDNA24-25
• 3.2.1.3 聚合酶链式反应(PCR)反应体系,SCARB2的PCR扩增25
• 3.2.1.4 DNA的片段电泳回收25
• 3.2.2 pET28a-SCARB2质粒的构建25-27
• 3.2.3 SCARB2的过表达27
• 3.2.4 SCARB2蛋白纯化27-28
• 3.2.5 SCARB2蛋白表达纯化实验结果28-29
• 3.2.6 蛋白浓度的测定29-31
• 第四章 SCARB2与EGCG-p、VP1的分子相互作用研究31-38
• 4.1 实验材料31-32
• 4.1.1 试剂溶液31
• 4.1.2 溶液31-32
• 4.2 实验方法32-35
• 4.2.1 SCARB2受体与VP1亲和力测定32-33
• 4.2.2 SCARB2受体与EGCG-p亲和力测定33
• 4.2.3 SCARB2+EGCG-p与VP1亲和力测定33-35
• 4.3 结果与讨论35-38
• 4.3.1 SCARB2受体与VP1的相互作用35-36
• 4.3.2 SCARB2受体与EGCG-p相互作用36-37
• 4.3.3 SCARB2+EGCG-p与VP1的相互作用37-38
• 第五章 讨论与总结38-40
• 5.1 讨论38
• 5.2 主要结论38-39
• 5.3 创新点39
• 5.4 不足与展望39-40
• 参考文献40-44
• 附图44-45
• 致谢45-46

【共引文献】

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  本文关键词：EGCG-p抗EV71病毒的分子作用机理，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：422401