NIX在CCCP诱导PC12细胞线粒体自噬调控作用的研究

发布时间：2017-06-27 16:01

  本文关键词：NIX在CCCP诱导PC12细胞线粒体自噬调控作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的NIX是近年来新发现的隶属于Bcl-2家族中的BH3-only促凋亡蛋白,又被称为Bcl-2/E1B 19kDa interacting protein 3-like(BLIP3L),其编码产物拥有Bcl-2家族的羧基末端跨膜结构域(TM)和BH3结构域。NIX定位于线粒体外膜,能通过BH3结构域和E1B19K、Bcl-X1、Bcl-2等蛋白相互作用,导致细胞色素c释放,引起细胞凋亡。大量研究证实,NIX蛋白在促进细胞存活中也扮演了重要角色,而且越来越多的证据显示人类多种疾病的发生与缺氧条件下NIX引起的线粒体自噬有着密切的关系。本课题我们主要在分子的水平上研究NIX对羰基氰化物间氯苯腙(carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone CCCP)诱导PC12细胞线粒体自噬的影响来进一步探讨NIX对CCCP诱导PC12细胞线粒体自噬的调控作用。方法1采用PCR技术构建NIX过表达重组慢病毒载体和NIX shRNA干扰重组慢病毒载体。2采用病毒感染PC12细胞的方式构建对照细胞株(NC)、NIX过表达细胞株、NIX shRNA干扰细胞株三种细胞模型。各组慢病毒稳定感染PC12细胞后,采用Western Blot技术检测细胞内NIX蛋白的表达情况,并通过免疫荧光技术进一步检测各组细胞NIX的表达。3将对照细胞、NIX过表达细胞、NIX shRNA干扰细胞作为我们的实验对象,分别对三组细胞使用不同浓度(0、10、20、30)μmol/l的CCCP处理6h,以及使用浓度为20μmol/l的CCCP处理不同时间(0、2、4、6)h,比较CCCP不同浓度、不同时间处理后对各组细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)和NIX蛋白表达量的影响,以及NIX过表达、NIX shRNA干扰对CCCP诱导PC12细胞线粒体自噬的影响。结果1.nix过表达重组慢病毒载体和nixshrna重组慢病毒载体构建成功,可用于下一步实验。2.成功构建对照细胞(nc)、nix过表达细胞(nix)、nix干扰细胞(nixshrna)三种细胞模型,与对照组细胞相比,nix过表达细胞中nix蛋白表达量显著升高,差异具有统计学意义(p0.05)。与对照组细胞相比,nixshrna干扰细胞中nix蛋白表达量显著降低,差异具有统计学意义(p0.05)。3.与同组细胞对照相比,经过cccp处理后对照组细胞、nix过表达细胞、nixshrna干扰细胞的ros均显著升高,差异具有统计学意义(p0.05)。4.与对照组细胞相比,nix过表达细胞ros含量降低,差异具有统计学意义(p0.05)。5.与对照组细胞相比,nixshrna干扰细胞ros含量降低,差异具有统计学意义(p0.05)。6.与同组细胞对照相比,经过高浓度cccp处理后,对照组细胞、nix过表达细胞nix蛋白表达量均明显降低,差异具有统计学意义(p0.05)。7.与同组细胞对照相比,经过cccp处理后,对照组细胞自噬逐渐增强,线粒体自噬逐渐减弱,差异具有统计学意义(p0.05)。与同组细胞对照相比,nix过表达细胞自噬逐渐增强,线粒体自噬增强,差异具有统计学意义(p0.05)。8.与对照组细胞相比,当cccp浓度达到30μmol/l时,nix过表达细胞自噬和线粒体自噬明显增强,差异有统计学意义(p0.05)。9.与同组细胞对照相比,经过cccp处理后,nixshrna干扰细胞自噬增强,线粒体自噬减弱,差异具有统计学意义(p0.05)。10.与对照组细胞相比,经过cccp处理后,nixshrna干扰细胞自噬和线粒体自噬显著减弱,差异具有统计学意义(p0.05)。结论1.CCCP促进细胞ROS的产生。2.NIX过表达、NIX shRNA干扰抑制CCCP处理后细胞ROS的产生。3.高浓度的CCCP促进细胞中NIX蛋白的降解。4.NIX能促进CCCP诱导PC12细胞线粒体自噬的发生。
【关键词】：CCCP ROS 线粒体自噬 NIX PC12
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 1 实验材料18-22
• 1.1 主要仪器设备18
• 1.2 抗体18-19
• 1.3 主要试剂及常用试剂配方19-22
• 2 实验方法22-30
• 2.1 细胞培养22
• 2.2 细胞计数22
• 2.3 NIX慢病毒表达载体和NIX shRNA慢病毒表达载体的构建、包装及滴度测定22-24
• 2.4 NIX过表达和NIX干扰细胞模型的构建24-25
• 2.5 各组慢病毒稳定感染PC12细胞中NIX蛋白的表达25-27
• 2.6 免疫荧光技术检测细胞NIX的表达27
• 2.7 DCFH-DA探针分子测定各组细胞ROS的含量27-28
• 2.8 CCCP对细胞NIX蛋白表达的影响28
• 2.9 NIX过表达对CCCP诱导线粒体自噬的影响28-29
• 2.10 NIX干扰后对CCCP诱导线粒体自噬的影响29
• 2.11 数据处理及统计分析29-30
• 3 实验结果30-40
• 3.1 慢病毒载体的测序鉴定30-31
• 3.2 各组慢病毒稳定感染PC12细胞中NIX蛋白的表达情况31
• 3.3 荧光显微镜观察各组慢病毒稳定感染PC12细胞中NIX的表达31-32
• 3.4 各组细胞活性氧的含量32-34
• 3.5 CCCP对细胞NIX蛋白表达的影响34-35
• 3.6 NIX过表达对CCCP诱导的线粒体自噬的影响35-37
• 3.7 NIX干扰对CCCP诱导的线粒体自噬的影响37-40
• 4 讨论40-44
• 5 结论44-45
• 参考文献45-51
• 文献综述51-61
• 参考文献58-61
• 附录61-63
• 攻读学位期间的研究成果63-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Elisabetta Ceni;Tommaso Mello;Andrea Galli;;Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

2 Inna N Shokolenko;Glenn L Wilson;Mikhail F Alexeyev;;Aging:A mitochondrial DNA perspective,critical analysis and an update[J];World Journal of Experimental Medicine;2014年04期

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本文编号：490344