中东呼吸综合征冠状病毒受体结合区蛋白在昆虫细胞中的重组表达与免疫保护作用研究

发布时间：2017-06-29 03:01

  本文关键词：中东呼吸综合征冠状病毒受体结合区蛋白在昆虫细胞中的重组表达与免疫保护作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达MERS-Co V S1和RBD蛋白,明确其作为重组疫苗靶抗原的免疫原性和诱导中和抗体的能力;利用制备的S1重组蛋白筛选制备具有中和活性的抗MERS-Co V单克隆抗体。方法:(1)构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染SF9细胞包装杆状病毒。重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白。利用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;通过假病毒以及活病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。同时利用重组表达S1蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-Co V假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。(2)利用生物信息学方法对MERS-Co V S1基因序列、二级结构、柔性分析;同时对MERS-Co V RBD、MERS-Co V单克隆抗体及MERS-Co V RBD与细胞受体DPP4结合的晶体结构进行分析预测在S1内部具有免疫保护功能区段355-590aa;针对预测的免疫功能保护区设计添加foldon序列,构建含有MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd基因的重组杆状病毒质粒,转染SF9细胞包装杆状病毒。重组病毒传代3次获得种子病毒进而感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得RBD、RBDFd重组蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;通过假病毒以及活病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:(1)获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,并在昆虫细胞中成功表达和纯化了分子量约140k D S1重组蛋白。利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠三次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1:102400;免疫小鼠血清稀释5120倍后中和百分比仍能达到50%以上,且具有良好的活病毒中和活性。(2)利用重组的MERS-Co V S1蛋白筛选获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类为6株为Ig G1型,2株为Ig G2a型,2株为Ig M型;10株单抗抗体ELISA效价达到10000以上,并获得1株单抗对MERS-Co V具有良好的中和活性。(3)获得了表达MERS-Co V RBD、MERS-Co V RBD Fd蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中成功表达并纯化了分子量约40k D MERS-Co V RBD单体重组蛋白以及分子量约100k D MERS-Co V RBDFd寡聚体蛋白。利用重组表达的RBD单体蛋白免疫小鼠三次,血清MERS-Co V RBD特异性Ig G抗体滴度可达1:6400;免疫小鼠血清稀释3200倍后中和百分比低于50%,对MERS-Co V假病毒的中和活性较弱。而利用形成寡聚体的RBD蛋白在一次加强免疫后,血清中MERS-Co V RBDFd特异性Ig G抗体滴度可达1:102400;免疫小鼠血清稀释12800倍后中和百分比仍高于50%。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能够有效诱导产生高滴度保护性中和抗体,筛选制备出一株具有良好中和活性的MERS-Co V单克隆抗体。重组表达的MERS-Co V RBD单体蛋白免疫原性以及对假病毒中和活性都较弱;利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V RBDFd寡聚体重组蛋白具有很强的免疫原性,能够有效诱导产生高滴度中和抗体,对MERS-Co V假病毒以及活病毒都具有很好的中和活性。该研究为发展一种安全有效的针对MERS-Co V的预防疫苗奠定了坚实基础。图35幅,表4个。参考文献57篇。
【关键词】：MERS病毒 受体结合区 单克隆抗体
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 符号说明11-12
• 1 前言12-16
• 2.MERS病毒S1蛋白重组表达及抗S1蛋白单克隆抗体的制备16-31
• 2.1 材料与方法16-22
• 2.2 结果22-29
• 2.2.1 MERS病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及鉴定22-24
• 2.2.2 MERS病毒S1重组蛋白免疫原性及免疫反应特征分析24-26
• 2.2.3 MERS病毒S1重组蛋白免疫小鼠血清抗体中和活性检测26
• 2.2.4 抗MERS病毒S1单克隆抗体的制备及鉴定26-29
• 2.3 讨论29-31
• 3 MERS病毒RBD蛋白在昆虫细胞中重组表达及免疫保护作用分析31-50
• 3.1 材料与方法31-36
• 3.2 实验结果36-47
• 3.2.1 MERS病毒RBD重组蛋白在昆虫细胞中重组表达与鉴定36-42
• 3.2.2 MERS病毒RBD重组蛋白抗原性及免疫反应特征分析42-43
• 3.2.3 MERS病毒RBD重组蛋白免疫小鼠血清抗体活病毒中和活性分析43-44
• 3.2.4 SARS病毒RBD与MERS病毒RBD交叉反应性以及交叉中和活性的比较44-47
• 3.3 讨论47-50
• 4. 结论50-51
• 参考文献51-55
• 附录55-61
• 攻读硕士期间研究成果61-62
• 简历62-63
• 致谢63-65
• 综述65-74
• 参考文献72-74

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本文编号：496248