空肠弯曲菌荚膜多糖遗传特征及弯曲菌感染的宿主归因分析

发布时间：2017-07-07 01:20

  本文关键词：空肠弯曲菌荚膜多糖遗传特征及弯曲菌感染的宿主归因分析

  更多相关文章： 弯曲菌 全基因组测序 荚膜多糖 血清分型 多位点序列分型 宿主归因

【摘要】：弯曲菌(Campylobacter)作为重要的食源性病原菌,仍然是包括中国在内的许多国家所面临的公共卫生问题,同时,弯曲菌也是引起细菌性肠炎最常见的原因之一。其中与人类疾病密切相关的种属大多为空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。本研究中对28株中国空肠弯曲菌菌株进行了全基因组测序,同GenBank数据库中其他国家的10株完成图的全基因组测序进行了聚类。从分析结果我们观察到地缘性的隔离并不会影响种群的结构；而相同血清型聚集在同一个分支上,这说明血清型相关遗传因子可能对种群有重要影响。空肠弯曲菌的荚膜多糖是一个重要的毒力因子,与细胞表面多糖的多样性共同决定血清型。目前已有34种荚膜多糖基因结构被报道,并且有些也能够通过多重PCR进行检测。HS1/44c、HS2、HS4c、HS19、HS23/36c和HS41等血清型是引起格林-巴利综合征(GBS)菌株的标志性血清型,空肠弯曲菌的荚膜多糖脂寡糖对GBS的发病及易感性都有重要的作用。通过对18个CPS合成相关基因簇的序列分析得知,荚膜多糖基因簇具有明显的基因多样性及荚膜多糖基因簇类型之间的拼接性,主要由于基因缺失或获得以及基因的水平转移引起的；CPS合成相关基因分析显示,主要基因组成为糖合成基因、糖基转移酶基因和甲基磷酸酯合成相关基因,研究发现在某些血清型的荚膜多糖基因簇中存在一些相对保守的基因(如甲基磷酸酯合成相关基因和八碳糖合成相关基因)。本研究建立了多重PCR方法鉴定五种特定血清型及三种GBS相关血清型。根据荚膜多糖基因的旁系同源基因或独特DNA区域能够设计出针对每种荚膜类型的引物。通过对已知血清型的对31株菌株进行验证,该多重PCR方法可以有有效区分以上八种血清型,并且敏感性和特异性都是100%。目前已有几个国家和地区开展多位点序列分型(MLST)在弯曲菌的宿主归因分析,而在中国还没有相关报道。本研究建立宿主归因的方法得到中国菌株的宿主归因情况。我们对中国777株弯曲MLST的进行分子方差分析(使用Alequin软件)和归因模型分析(使用Structure软件),来对中国弯曲菌的感染进行宿主归因,其中临床分离株272株,鸡来源菌株309株、猪来源菌株119株,牛、鹅和鸭子来源的菌株数量分别为11株、18株和7株。同时也对中国菌株与外国9个来源的共3695菌株进行了比较,分析各种群之间的遗传距离和宿主归因的可能性。结果显示,中国空肠弯曲菌主要归因于鸡来源菌株,中国结肠弯曲菌主要归因于猪来源菌株。与外国的比较结果显示,中国空肠弯曲菌归因于欧美的鸡来源的可能性较高,而归因于新西兰牛来源菌株的可能性较高；中国结肠弯曲菌归因于英国猪来源的可能性比较高,而归因于美国鸡来源的可能性较高。中国各宿主与国外菌株比较显示,中外宿主种群结构也是有一定差异的。本研究建立了弯曲菌宿主归因方法,通过对食物链从养鸡场到零售过程中传播进行疾病预防干预有重要意义。
【关键词】：弯曲菌 全基因组测序 荚膜多糖 血清分型 多位点序列分型 宿主归因
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略词7-9
• 论文摘要9-11
• Abstract11-13
• 第一部分 空肠弯曲菌荚膜多糖遗传特异性分析及其PCR检测方法的建立13-46
• 1 前言13-15
• 2 材料与方法15-27
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 实验菌株15-16
• 2.1.2 主要仪器耗材16-17
• 2.1.3 主要试剂及溶液17-18
• 2.2 方法18-27
• 2.2.1 试剂盒提取弯曲菌基因组DNA18-19
• 2.2.2 试剂盒法血清型鉴定实验步骤19
• 2.2.3 全基因组测序流程19-21
• 2.2.4 基于核心基因组的SNP的NJ树构建21
• 2.2.5 全基因组测序及CPS位点序列的获得21-24
• 2.2.6 CPS合成相关基因簇聚类建24
• 2.2.7 直系同源分配24
• 2.2.8 CPS相关序列比对和PCR的开发24-26
• 2.2.9 多重PCR检测验证26-27
• 3 结果27-40
• 3.1 全基因组NJ树27
• 3.2 CPS的系统发育和遗传多样性27-33
• 3.2.1 CPS合成相关基因簇的NJ树构建29-30
• 3.2.2 CPS遗传多样性30-33
• 3.3 CPS同源基因的多样性33-35
• 3.4 GBS相关血清型CPS合成相关基因簇序列特征及特异序列35
• 3.5 多重PCR方法验证血清型建立35-40
• 4 讨论40-45
• 5 小结45-46
• 第二部分 弯曲菌多位点序列分型及宿主归因分析46-65
• 1 前言46-48
• 2 材料与方法48-55
• 2.1. 材料48-51
• 2.1.1 实验菌株48-50
• 2.1.2 主要仪器、耗材50
• 2.1.3 主要试剂及溶剂50-51
• 2.2 方法51-55
• 2.2.1 MLST PCR扩增基因以及引物序列51-52
• 2.2.2 MLST分析用基因测序引物序列52-53
• 2.2.3 PCR体系配制53-54
• 2.2.4 PCR扩增程序54
• 2.2.5 PCR产物电泳验证和纯化54
• 2.2.6 ST(Sequence Type)型别确定54
• 2.2.7 基于MLST结果的种群遗传距离分析和宿主归因分析54-55
• 3 结果55-62
• 3.1 中国菌株ST型分布频数55-56
• 3.2 空肠弯曲菌归因分析结果56-59
• 3.2.1 中国菌株分子方差分析结果56-57
• 3.2.2 中国临床分离株宿主归因57
• 3.2.3 不同国家地区C.jejuni临床株分子方差分析57-58
• 3.2.4 中国临床分离株与国外来源菌株归因分析58-59
• 3.3 结肠弯曲菌归因分析结果59-61
• 3.3.1 中国菌株分子方差分析结果59
• 3.3.2 中国临床分离株宿主归因59-60
• 3.3.3 不同国家地区C.coli临床株分子方差分析60
• 3.2.4 中国临床分离株与国外来源菌株归因分析60-61
• 3.4 中国主要宿主菌株与国外菌株菌株种群遗传距离61-62
• 4 讨论62-64
• 5 小结64-65
• 参考文献65-70
• 综述70-76
• 参考文献74-76
• 附录76-95
• 硕士研究生期间主要成果95-96
• 致谢96

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