pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建及鉴定

发布时间：2017-08-02 20:11

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【摘要】：目的构建并鉴定pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒,为深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病的生物学作用奠定基础。方法提取He La细胞总RNA,反转录出含Argonaute1的c DNA;以Argonaute1 c DNA为模板,采用PCR法扩增出带有EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到pmCherry-C1载体上;将构建成功的pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒转染入He La细胞内,以Western blotting法检测Argonaute1与樱桃红(Cherry)蛋白的融合表达情况;以激光共聚焦显微镜观察细胞内Argonaute1蛋白与细胞应激颗粒的标记蛋白(G3BP)及加工体的标记蛋白(DCP1α)的应激共定位关系。结果以EcoRⅠ、Bam HⅠ单、双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误;融合蛋白表达阳性;当细胞受到应激时,Argonaute1蛋白与G3BP、DCP1α蛋白共定位。结论本研究成功构建重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒。该质粒可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白,有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病领域的生物学作用。
【作者单位】： 天津医科大学;
【关键词】： 人类Argonaute蛋白 pmCherry-C 重组质粒 融合蛋白 应激颗粒
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31370749/31571380) 国家杰出青年基金资助项目(31125012) 教育部“创新团队发展计划”(IRT13085) 天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCQNJC09900)
【分类号】：Q782;R3416
【正文快照】： 应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白,参与RNA干扰及应激颗粒(SGs)、加工体(PBs)形成等多种细胞生物学过程[1~3]。pm Cherry-C1是一种可以编码红色荧光蛋白的真核表达载体。2015年9~11月,本研究通过基因工程技术将Argonaute1基因片段连接至pm Cherry-C1载体,构建pm Cherry-C1-

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