常用实验动物与人肠道、口腔、生殖道微生物组比较

发布时间：2017-08-08 14:27

  本文关键词：常用实验动物与人肠道、口腔、生殖道微生物组比较

  更多相关文章： 实验动物 肠道菌群 口腔菌群 生殖道菌群 细菌 16Sr RNA

【摘要】：研究背景微生物(Microorganism)是一类种类繁多,数量巨大且个体难以用肉眼观察的微小生物,它们是地球生物的主要组成部分。人体内的微生物对维持机体的健康发挥着至关重要的作用,它们从生长、发育、消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、药物代谢等诸多方面影响人类健康状况,人体微生物中超过99%为细菌,这个集体我们统称为菌群。人体内的菌群大致可分为两类：1、定居菌群：由相当固定的微生物所组成,有规律地存在于特定部位或只见于特定年龄。如果菌群有了改变,能有较强的恢复能力。2、暂居菌群：由非致病性的或潜在致病性的微生物所组成,暂时存在于皮肤或粘膜上几小时至几周。只要定居菌群保持正常,暂居菌群一般并不重要；但若定居菌群失常,则暂居的潜在致病性微生物即能大量增殖,并引起疾病。一般情况下,菌群与宿主存在三种关系,即：互利共生(Mutualists)、共栖(Commensals)、致病(Pathogens)。定居菌群与宿主相互依赖,彼此得益,通常表现为：一方面,宿主为定居菌群提供营养和生存空间,另一方面,定居菌群帮助宿主抵御外来致病源的入侵,以保持机体健康。研究者发现,与人体相关的定居菌群对人体发育、免疫功能、营养吸收和能量代谢有着重要的影响,一旦失衡会引起很多慢性疾病,如代谢综合征、肥胖、糖尿病甚至癌症等。美国微生物学教授Savage把微生态系统列为诸如呼吸、循环、消化系统等一样的人类第十大系统。在医学领域,定居人体并与人体共生的定居菌群基因组被称为人的“第二基因组”(the other genome)。人类“第一基因组”及““第二基因组”共同决定了人体的健康与疾病的状态。近年来16S rRNA基因测序方法的应用,使我们对人体菌群结构和组成的认识显著提高。医学研究离不开实验动物,无论是美国还是中国的食品药品监督管理局都规定新药研发临床前必须经过啮齿类动物和非啮齿类哺乳动物的实验。现代的研究中对于人体菌群研究很多,美国NIH发起的“人类微生物组计划”,从2008年到2013年,花了1.2亿美元,对300个志愿者全身各部位微生物进行测序,破解了3000种微生物全基因组,初步建立了人体共生微生物参考数据库。欧盟发起的“人类肠道宏基因组计划”(MetaHIT,Metagenomics of the Human Intestinal Tract),8个国家14个研究机构参与,从2008年1月1日到2012年6月30日,花了2200万欧元,确定了肠道微生物的330万个基因。相比较而言,关于常用实验动物菌群的研究却鲜有报道。国内外对于肠道疾病研究常采用的实验动物模型主要是用大小鼠来建立的,啮齿类动物虽然有个体小,易于操作,价格便宜等优点,但在解剖、生理和代谢等方面与人之间存在较大的差异。大实验动物中,猪与人类在结构和功能上有很多相似之处；犬的消化系统发达,与人有相同的消化过程,常用于慢性消化系统的研究；猴的生物学特性与人极为相似,常用于脑功能研究、血液循环、呼吸生理、内分泌、生殖生理的各方面的研究。基于以上特点,研究大动物的菌群结构,为科学研究提供基础数据十分有必要。本研究采用基于细菌16S rRNA高通量测序法,选取了几种常用的实验动物(西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔以及Wistar大鼠)作为研究对象,分析了它们肠道、口腔及生殖道的菌群分布结构,初步讨论常用的模型动物与人有关菌群的差异和相似性,以此为人体微生态方面的医学研究提供基础性资料,并为在选择研究微生态使用的模型动物时提供一些参考,期望能够为进一步研究疾病和菌群之间的关系找到合适的动物模型。基于细菌16S rRNA进行测序的第二代高通量测序技术,具有通量高,成本低廉的优点,能够显著改善传统微生物研究方法的不足,获得比较理想的微生物群落数据,为我们研究微生物生态学奠定了良好的方法学基础,使得我们能够更进一步了解微生物的结构与特征。研究目的采用基于细菌16S rRNA高通量测序法,研究几种常用实验动物(西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠)的菌群结构以及它们各自的特点和差异性,并和正常人的数据进行比对分析,初步讨论常用实验动物与人有关菌群的差异和相似性,以此为人体微生态方面的医学研究提供基础性资料,并为在选择研究微生态使用的实验动物模型时提供一些参考。研究方法第一章肠道菌群样品采集及数据分析采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠新鲜粪便,收集于EP管中,每个品种4只(成年),雄性1只,雌性3只；共20个样品,-20℃保存。人的肠道菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。经粪便样品基因组DNA提取后,用细菌16S rRNA通用引物,PCR扩增样品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下的原始数据序列,高通量测序数据用BIPES (Barcoded Illumina Paired-end(PE) Sequencing)流程进行初步原始序列处理,采用分阶段聚类算法Two-Stage-Clustering(TSC)将干净序列聚类成操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs),OTU聚类过程中主要采用三种距离法：最远距离法、最近距离法、平均距离法。对于获得的OTUs,使用GAST(Global Alignment for Sequence Taxonomic)算法对其进行分类。用Mothur方法获得样品的α多样性分析(Shannon index,PD_whole_tree,Observed OTU,Chaol, ACE),即单个样品包含种属数量的多少；基于Unifrac距离,采用QIIME进行主成分分析,分析p多样性,即不同样品之间菌群结构的比较；采用线性判别式分析效应值(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe),Galaxy89在线工具寻找不同组别之间有统计学差异的菌群标志物(即Biomarker),LEfSe分析首先采用Kruskal-Wallis秩和检验检测组间丰度差异显著的种属,然后用成组的Wilcoxon秩和检验对差异显著的物种种属进行组间差异分析,最后用LDA对数据进行降维,评估差异显著种属的影响力(即LDA score)。应用IBM SPSS Statistics 20软件进行统计分析,基于符合正态分布的数据,采用One-Way ANOVA进行Bonferroni法两两比较分析,校正检验水准；基于不符合正态分布的数据,采用Kruskal-Wallis One-way ANOVA进行两两比较,校正检验水准。采用GraphPad prism5软件工具对PD_whole_tree、 Shannon等作图。第二章 口腔菌群样本采集及数据分析用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠新鲜口腔菌群样品,每个品种4只(成年),雄性1只,雌性3只；共20个样品,-20℃保存。人的口腔菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。经过细菌总DNA提取后,用细菌16S rRNA通用引物,PCR扩增样品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下的原始数据序列,数据的处理方法与第一章相同。第三章 生殖道样本采集及数据分析用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴生殖道菌群样品,每个品种3只(成年),-20℃保存。人的生殖道菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。经过细菌总DNA提取后,用细菌16S rRNA通用引物,PCR扩增样品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下的原始数据序列,数据的处理方法与第一章相同。研究结果第一章 肠道菌群结构分析1、α多样性分析中,PD_whole_tree指数,人与西藏小型猪、猕猴的差异显著(P0.05),西藏小型猪与猕猴、比格犬、新西兰大白兔、Wistar大鼠差异显著(P0.05),其余物种间均无显著差异(P0.05)；Shannon指数,人和西藏小型猪差异显著(P0.05),西藏小型猪与比格犬、新西兰大白兔差异显著(P0.05),其余物种间均无显著差异(P0.05)。2、p多样性分析表明,比格犬的未加权UniFrac距离和人最接近,西藏小型猪的加权UniFrac距离和人的距离最近,菌群相似度最高。3、菌群结构门水平中,西藏小型猪与人的肠道菌群门结构水平最为相近。菌群结构属水平中,人的肠道菌群中拟杆菌属(Bacteroides)的比例最高,其次为普氏菌属(Prevotella)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)及梭杆菌属(Fusobacterium),占人肠道菌群的60%以上。猪、猴、鼠的肠道菌群中普氏菌属(Prevotella)均占有较大比例,但是猪的肠道菌群主要以普氏菌属(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)及密螺旋体属(Treponema)为主；猴的肠道菌群以乳酸杆菌属(Lactobacillus)、颤杆菌克属(Oscillibacter)为主；鼠的肠道菌群以普氏菌属(Prevotella)、贪噬菌属(Variovorax)为主。犬的肠道菌群以鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)为主。兔的肠道菌群以拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)为主。第二章口腔菌群结构分析1、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠样品20个及人口腔样品15个,质控后获取了939272条干净的16S rRNA基因序列,获得的最低基因序列为101条,35个样品全部纳入后续分析。2、α多样性分析表明,人、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠口腔菌群Shannon指数均无显著差异(P0.05)。人与猪、犬、猴、兔、大鼠差异显著(P0.05),猪与犬、猴、兔差异显著(P0.05),其他均无显著差异(P0.05)。3、p多样性分析表明,未加权UniFrac距离比较中,西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠的口腔菌群的丰富度比较相近,这可能是由于实验动物特定的生活环境造成的；相对而言,猴和猪与人的距离较为接近,表明猴和猪与人的口腔菌群菌落的相似度高于其他物种。加权UniFrac距离中,考虑到丰度的关系,猴和人距离较近,相似度较高。4、人的口腔菌群门结构水平中有五个门的细菌占主要地位,分别是：放线菌门(Actinobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。猪、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群门结构水平均以变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为主,占50%以上,猪、猴、大鼠的门结构水平较为相似,都有放线菌门{Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)。相比较而言,猪的口腔菌群门水平更接近人。不同物种口腔菌群在属水平上存在差异较大,五个物种都有奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、卟啉菌属(Porphyromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella),口腔链球菌属(Streptococcus)、放线菌属(Actinobacillus)、梭杆菌属 (Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)。第三章生殖道菌群结构分析1、西藏小型猪、比格犬、猕猴样品9个与30～50岁健康人群的样品10个,共19个样品质控后获取了135191条干净的16S rRNA基因序列,获得的最低基因序列为1935条,19个样品全部纳入后续分析。2、a多样性分析表明,各物种间均无统计学意义,说明猪、犬、猴和人的生殖道菌群无显著差异(P0.05)。3、p多样性分析亦表明,猪、犬、猴和人的生殖道菌群无显著差异(P0.05)。4、人、猪、犬、猴生殖道菌群门水平均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)为主。其中西藏小型猪与人的生殖道菌群门结构水平较为相近,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)占所有菌群门水平的90%以上,犬和猴的门结构水平较为相似,梭杆菌门(Fusobacteria)占10-20%以上。四个物种的属水平分布大不相同。但总的看来人的生殖道菌群中含有的普雷沃菌属(Prevotella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)在猪、犬、猴的生殖道菌群中都有出现。研究结论：1、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠与人的肠道菌群在属水平上存在较大差异,西藏小型猪和猕猴可能是适合做饮食结构相关的研究的模型动物,猕猴可能是适合做关节炎及与肥胖疾病相关的模型动物,比格犬可能是适合做与慢性消化系统疾病相关的模型动物。2、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠与人的口腔菌群结构各不相同,在菌群的丰富度和相似程度上,猴最接近人。猴可能是研究与梭杆菌门相关口腔疾病较适宜的动物模型,猪可能是与变形菌门相关口腔感染性疾病较为合适的模型动物,犬可能是研究与螺旋体门相关的慢性牙周病较为合适的模型动物。3、西藏小型猪、比格犬、猕猴生殖道菌群与人从菌群丰富度和多样性上均无显著差异,猴可能是研究与普氏菌属相关的阴道感染性疾病较为合适的模型动物,猪可能是研究与链球菌或不动杆菌相关的细菌性阴道炎较为合适的模型动物,犬可能是研究与乳酸杆菌属相关疾病的模型动物。
【关键词】：实验动物 肠道菌群 口腔菌群 生殖道菌群 细菌 16Sr RNA
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R37
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 前言20-25
• 第二章 常用实验动物与人肠道菌群比较25-38
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 试剂与耗材25
• 2.1.2 仪器25-26
• 2.2 方法26-30
• 2.2.1 样品采集26
• 2.2.2 粪便样品基因组DNA提取26-27
• 2.2.3 细菌16S rRNA V4区域扩增27-28
• 2.2.4 Illumina solexa测序28-29
• 2.2.5 数据分析29-30
• 2.3 结果30-36
• 2.3.1 测序与质量控制30
• 2.3.2 常用实验动物与人肠道菌群之比较30-36
• 2.4 讨论36-37
• 2.5 小结37-38
• 第三章 常用实验动物与人口腔菌群比较38-50
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 试剂与耗材38
• 3.1.2 仪器38-39
• 3.2 方法39-42
• 3.2.1 样本采集39
• 3.2.2 细菌总DNA提取39-41
• 3.2.3 16S rRNA基因扩增41-42
• 3.2.4 Illumina solexa测序42
• 3.2.5 数据分析42
• 3.3 结果42-48
• 3.3.1 测序与质量控制42-43
• 3.3.2 实验动物与人口腔菌群结构比较43-48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-50
• 第四章 常用实验动物与人生殖道菌群比较50-60
• 4.1 材料50-51
• 4.1.1 试剂与耗材50
• 4.1.2 仪器50-51
• 4.2 方法51-54
• 4.2.1 样本采集51
• 4.2.2 细菌总DNA提取51-53
• 4.2.3 16S rRNA基因扩增53-54
• 4.2.4 数据分析(同2.2.5)54
• 4.3 结果54-58
• 4.3.1 测序与质量控制54
• 4.3.2 常用实验动物与人生殖道菌群比较54-58
• 4.4 讨论58-59
• 4.5 小结59-60
• 全文小结60-61
• 参考文献61-67
• 附录67-70
• 致谢70-71

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本文编号：640464