B型流感病毒反向遗传平台的构建及其应用

发布时间：2017-08-19 15:03

  本文关键词：B型流感病毒反向遗传平台的构建及其应用

  更多相关文章： B型流感病毒 生长特性 系间重配 反向遗传

【摘要】：研究目的：构建B型流感病毒反向遗传技术平台,并利用该反向遗传系统构建B型流感重配病毒,研究影响病毒生长特性的因素。研究方法：利用A型流感病毒反向遗传系统pHW2000载体为骨架,构建B型流感病毒反向遗传平台,即构建包含病毒各节段的8个重组质粒,将重组质粒混合后共转染293T及MDCK混合细胞,培养后以鸡胚或细胞传代拯救B型流感病毒重配病毒；根据病毒基因组序列特点,挑选2013-2015年间我国分离的B型野生型及系间重配流感病毒作为研究对象,利用半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose,简称TCID50)方法计算病毒液含有的颗粒数,稀释病毒液至颗粒数相同后再感染MDCK细胞,收集各时间点的病毒培养液,进行病毒滴定,以培养时间点为横坐标,各时间点下病毒滴度为纵坐标,获得病毒生长曲线；检测病毒神经氨酸酶活性,并以酶活动力学常数Km值表示；尝试利用构建的B型流感反向遗传系统,拯救不同组合的重配B型流感病毒,测定重配病毒的生长特性,分析影响病毒生长特性的因素。主要结果：成功构建了B型流感病毒反向遗传技术平台并加以应用；发现2013-2015年我国分离的野生型病毒及系间重配病毒的生长曲线走势相似,在感染后的0-48h病毒滴度不断上升,可维持至72h后病毒滴度逐渐下降,病毒的Km值分布于16-40之间；利用该B型流感病毒技术平台构建了不同片段替换方式的重配病毒,对重配病毒进行生长曲线检测,结果显示单一替换基因片段对病毒的生长特性无显著影响,而三种多片段组合替换方式均可导致重配病毒生长特性降低。结论：利用A型流感病毒pHW2000为载体的反向遗传技术同样适用于B型流感病毒,并可利用该系统构建B型重配流感病毒以验证影响病毒生长特性的主要因素；多基因协同作用影响B型流感病毒的生长特性。
【关键词】：B型流感病毒 生长特性 系间重配 反向遗传
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.13
【目录】：

• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 构建B型流感病毒反向遗传技术平台12-32
• 1 材料与耗材12-15
• 1.1 细胞12
• 1.2 鸡胚12
• 1.3 病毒12
• 1.4 主要试剂与配制方法12-13
• 1.5 主要耗材13-14
• 1.6 主要仪器14-15
• 2 方法15-27
• 2.1 病毒核酸提取15
• 2.2 目的片段扩增实验15-17
• 2.3 琼脂糖凝胶电泳17
• 2.4 产物回收实验17-19
• 2.5 BsmBI限制性内切酶酶切体系19
• 2.6 载体连接实验19-20
• 2.7 细菌转化实验20-22
• 2.8 质粒提取22-23
• 2.9 转染实验23-27
• 3 结果27-29
• 3.1 目的片段获得及基因序列分析27-28
• 3.2 质粒构建28-29
• 3.3 拯救病毒及重配病毒鉴定29
• 4 讨论29-32
• 第二部分 利用反向遗传平台构建重配病毒并对重配病毒进行生长特性研究32-51
• 1 材料与耗材32-33
• 1.1 细胞32
• 1.2 鸡胚32
• 1.3 病毒32
• 1.4 主要试剂与配制方法32-33
• 1.5 主要耗材33
• 1.6 主要仪器33
• 2 方法33-39
• 2.1 细胞复苏与传代33
• 2.2 病毒细胞传代33
• 2.3 病毒鸡胚传代方法33-34
• 2.4 神经氨酸酶活性检测实验34-36
• 2.5 半数组织培养感染剂量(TCID_(50))实验36-38
• 2.6 病毒生长曲线实验38-39
• 2.7 拯救重配病毒39
• 3 结果39-48
• 3.1 病毒进化分析39-40
• 3.2 病毒生长曲线测定40-43
• 3.3 神经氨酸酶活性检测结果43-44
• 3.4 系间重配病毒的片段替换44-48
• 4 讨论48-51
• 第三部分 结论51-52
• 参考文献52-54
• 综述54-60
• 参考文献58-60
• 致谢60-62
• 附录 已发表文章全文62-66

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本文编号：701358