PHB2在TH17细胞中的调控作用

发布时间：2017-08-26 05:33

  本文关键词：PHB2在TH17细胞中的调控作用

  更多相关文章： PHB2 RORγt RNA干扰 TH17细胞

【摘要】：目的：TH17细胞不仅在细菌和真菌感染中具有重要保护作用,在自身免疫性疾病中也有重要作用。维甲酸相关孤儿核受体(Retinoid-related orphan receptor gammaT, RORγt)是TH17细胞关键性的转录因子,决定了TH17细胞的分化并诱导促炎因子如IL-17等的表达。通过前期质谱分析发现PHB2与RORγt具有相互作用,而PHB2是一种结构高度保守,分布广泛,表达丰富的膜蛋白家族成员,且在T细胞活化过程中是上调的,形成磷酸化复合物定位于T细胞线粒体内膜上,对维持线粒体的完整性和T细胞的活化,分化和生存具有重要意义。故本研究通过免疫共沉淀,RNA干扰等技术,以期探讨PHB2如何对TH17细胞分化发挥调控作用及其调控机制。方法：首先通过PCR技术扩增出PHB2完整序列,构建到HA-pIP表达质粒中,在人胚肾细胞HEK293T中共转染Flag-RORγt与HA-PHB2,通过免疫共沉淀技术验证PHB2与RORγt是否具有相互作用。构建约600bp大小的IL-17A启动子报告基因,用PEI转染法在HEK293T细胞系过表达PHB2,RORγt和报告基因,通过荧光素酶报告基因实验探讨PHB2对RORγt功能的影响。然后通过电转法在人淋巴细胞白血病Jurkat细胞株中过表达PHB2, RORγt和报告基因,通过荧光素酶报告基因实验探PHB2对RORγt功能的影响。设计两对针对PHB2的特异性shRNA,构建包装表达shRNA的慢病毒载体,同时构建一对过表达PHB2的慢病毒载体,两者均通过PEI法与质粒△8.9,VSV-G共同转染至HEK293T细胞中,48小时后收上清,通过超速离心法浓缩病毒备用。随后通过ficoll法分离出新生儿脐带血的PBMC,用试剂盒分选出Naive CD4+T细胞,体外诱导出TH17细胞。将针对PHB2的shRNA和过表达PHB2的慢病毒分别直接感染Flag-RORγt-Jurkat稳转株细胞和体外诱导分化出的TH17细胞,在病毒感染一周左右通过免疫印迹技术检测PHB2与RORγt蛋白水平的变化,利用RT-PCR分析PHB2对TH17细胞相关炎症因子基因水平的影响。结果：通过免疫共沉淀技术和免疫印迹结果可以看到相对于对照组,共转染Flag-RORγt和HA-PHB2组通过加入anti-HA抗体后用anti-Flag抗体免疫印迹可以看到较强的RORγt信号(或加入anti-Flag抗体后用anti-HA抗体免疫印迹可以看到较强的PHB2信号)。由此结果可以得出PHB2与RORγt具有相互作用。在HEK293T细胞和Jurkat细胞中的IL-17A启动子荧光素酶报告基因实验中,我们发现PHB2能够有效促进RORγt介导的IL-17A转录活性且成剂量依赖性。利用慢病毒形式过表达PHB2于Flag-RORγt-Jurkat稳转株细胞中,免疫印迹结果发现过表达PHB2蛋白可以增强RORγt蛋白水平的表达。在体外成功诱导出TH17细胞后,并且构建出针对PHB2的两对shRNA都具有较好的沉默效率,在Flag-RORγt-Jurkat细胞和TH17细胞中感染针对PHB2的shRNA慢病毒后,免疫印迹结果分析得出PHB2蛋白水平明显降低的同时,RORγt蛋白水平也有所下降。RT-PCR结果分析得出消减PHB2基因表达的同时TH17细胞炎症相关基因IL-17A下调约25%,IL-17F下调约50%。结论：本课题通过免疫共沉淀和荧光素酶报告基因技术明确了PHB2与RORγt具有相互作用,且得出PHB2能够促进RORγt介导的IL-17A启动子转录活性。最后通过RNA干扰技术,RT-PCR和免疫印迹技术进一步探讨了PHB2通过对RORγt的蛋白水平的调控从而影响TH17细胞相关细胞因子的转录水平,得出PHB2发挥对TH17细胞的正调控作用的结果。
【关键词】：PHB2 RORγt RNA干扰 TH17细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中英文缩写对照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 1 前言11-17
• 2 材料17-21
• 3 实验方法21-36
• 4 实验结果36-45
• 5 讨论45-48
• 6 结论48
• 7 参考文献48-55
• 个人简历55-56
• 致谢56-57
• 综述57-66
• 参考文献62-66

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本文编号：739977