Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证

发布时间：2017-09-12 03:24

  本文关键词：Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证

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【摘要】：目的构建核因子C(nuclear factor I-C,Nfic)基因3′非编码区(3′UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证micro RNA-20a(miR-20a)与其潜在靶基因Nfic的靶向关系。方法通过micro RNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出Nfic基因3′UTR序列,将此序列克隆至荧光素酶报告载体p MIR-Report Luciferase;将重组荧光素酶报告质粒与miR-20a mimics(实验组)或NCmimics(对照组)共同转染293-AD细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测2组细胞的荧光素酶活性,从而对Nfic与miR-20a的靶向调节关系进行鉴定。将miR-20a mimics和NC mimics分别转染骨髓基质细胞系ST2,裂解细胞提取蛋白后采用Western blotting检测NFIC蛋白的表达水平。结果构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测显示,与对照组相比,miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性(P0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,ST2细胞转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平明显下调。结论成功构建了Nfic基因3′UTR荧光素酶报告质粒,而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。
【作者单位】： 天津医科大学代谢病医院内分泌研究所 卫生部激素与发育重点实验室;天津医科大学基础医学院;
【关键词】： 微RNAs ′非翻译区 miR-a Nfic 骨髓基质细胞系 荧光素酶报告基因
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81271977,81472040)
【分类号】：R3416
【正文快照】： micro RNAs是一类约22个核苷酸组成的种类丰富且进化保守的单链非编码小分子RNA,可以通过与靶基因m RNA完全互补配对而降解m RNA,或者与m RNA的3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)部分互补配对而阻断蛋白质翻译,从而实现基因表达的转录后调控[1-2]。本课题组前期研究

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