小鼠B7-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

发布时间：2017-09-17 00:03

  本文关键词：小鼠B7-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

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【摘要】：目的:构建介导小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒载体,研究其对L929细胞表面B7-1分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1基因编码区选择3段RNA干扰靶序列,制备转录双发夹RNA的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1的RNAi慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T细胞GFP表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒稳定感染的L929细胞,流式细胞术分析细胞中GFP及B7-1分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T细胞混合培养,分析B7-1稳定沉默细胞刺激T细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1基因RNA干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3~5)×10~8TU/ml的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929细胞介导GFP表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T细胞增殖的能力显著下降(P0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929细胞表面B7-1分子表达,抑制B7-1/CD28信号诱导的T细胞增殖效应。
【作者单位】： 苏州大学医学部免疫学系;苏州大学生物医学研究院;苏州大学附属儿童医院呼吸科;
【关键词】： B- RNAi 慢病毒 共刺激信号 L
【基金】：国家自然科学基金面上项目(81373236)资助
【分类号】：R392
【正文快照】： 1本文受国家自然科学基金面上项目(81373236)资助。2苏州大学生物医学研究院,苏州215123。3苏州大学附属儿童医院呼吸科,苏州215000。B7-1是重要的T细胞共刺激分子,与表达于T细胞表面的CD28/CTLA4结合所转导的细胞信号对T细胞活化反应的维持和免疫应答的扩大具有关键作用[1],

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【共引文献】

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本文编号：866052