呼吸道合胞病毒感染导致大鼠肾病病理模型持续感染证据研究

发布时间：2017-09-17 10:02

  本文关键词：呼吸道合胞病毒感染导致大鼠肾病病理模型持续感染证据研究

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【摘要】：目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染SD大鼠的肾病病理模型中,RSV持续感染证据。方法选取2个月龄、体重为180~200g的清洁级雄性SD大鼠62只为研究对象。采用随机数字表法将其随机分为RSV组(n=35)与对照组(n=27)。1对RSV组SD大鼠,采用毒力疱斑形成单位(PFU)为6×106 RSV液(0.4mL/d腹腔注射+0.2mL/d鼻腔滴注)×3d处理,建立RSV感染SD大鼠肾病病理模型。对照组采用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.4mL/d腹腔注射+0.2mL/d鼻腔滴注)×3d处理,建立对照组PBS模型。两组均以造模前1d计算为第0天,造模结束时计算为造模成功第1天。通过电子显微镜观察RSV感染SD大鼠肾病病理模型造模结束后第7与60天的肾小球超微结构改变,判断SD大鼠肾病病理模型造模是否成功。2RSV组SD大鼠肾病病理模型造模成功后,将35只SD大鼠平均分为7个亚组(RSV 0、7、15、30、60、90及120d亚组),每个亚组均为5只SD大鼠;将对照组27只PBS模型SD大鼠,按照上述时间点分为7个亚组(PBS 0、7、15、30、60、90及120d亚组),每个亚组分别为5、5、5、3、3、3、3只SD大鼠。分别测定各个RSV亚组与PBS亚组SD大鼠的24h尿蛋白定量、血清白蛋白及血清肌酐水平等指标,并进行统计学分析。3于上述指标测定完毕后,分别于上述时间点处死RSV亚组与PBS亚组SD大鼠。同时,切除SD大鼠左肾下2/3、左肺下2/3和脾下2/3,以4%多聚甲醛固定24h后,石蜡包埋后切片,采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各个亚组SD大鼠肾、肺、脾组织是否发生病理学形态结构改变。4以RSV G蛋白单克隆抗体为一抗,制作RSV组SD大鼠肾、肺、脾组织免疫组化检测标本,于光镜下寻找各个RSV亚组RSV G蛋白存在证据。5以RSV G蛋白单克隆抗体为一抗,采用与绿色荧光试剂结合,同时采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料蓝染细胞核,制作各个RSV亚组SD大鼠肾组织荧光免疫检测标本,于荧光显微镜下寻找RSV G蛋白存在证据及其与细胞核关系。6切除剩余RSV亚组左肾上1/3,以3%戊二醛固定后,送至四川大学华西医院病理科制作电子显微镜标本,于电子显微镜下观察各个RSV亚组SD大鼠肾小球超微结构是否发生病理改变,同时寻找RSV颗粒。结果 1RSV组SD大鼠肾病病理模型造模成功,对照组PBS模型亦造模成功。2各个RSV亚组与PBS亚组SD大鼠的24h尿蛋白定量水平检测结果显示,RSV 0与90d亚组分别与相同时间点PBS亚组比较,差异均无统计学意义(P0.05);而RSV 7、15、30、60及120d亚组,却分别较相同时间点PBS亚组均显著升高,并且差异均有统计学意义(t=6.9、3.1、3.9、2.2、5.6,P0.05)。血清白蛋白及血清肌酐水平检测结果显示,7个RSV亚组分别与相同时间点的7个PBS亚组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。3于光镜下观察各个RSV亚组SD大鼠的肾、肺、脾组织形态结构(HE染色)结果显示,除RSV 0d亚组外,其余各个亚组肾、肺、脾组织形态结构均出现不同程度病理改变。4于光镜下观察各个RSV亚组SD大鼠的肾、肺、脾组织免疫组化技术检测结果显示,除RSV 0d亚组外,其余各个RSV亚组肾、肺、脾组织中,均有特异性RSV G蛋白呈持续阳性表达。各个RSV亚组肾小球RSV G蛋白定量分析结果显示,RSV 0、7、15及30d亚组RSV G蛋白表达水平呈逐渐增强趋势,并维持在高水平,但在RSV 60、90及120d亚组又呈逐渐减弱趋势。5于荧光显微镜下观察各个RSV亚组SD大鼠肾组织RSV G蛋白荧光免疫检测结果显示,RSV G蛋白与DAPI蓝染的细胞核重叠。6透射电子显微镜下观察发现,RSV组肾组织中RSV颗粒持续存在,RSV 120d亚组肾小球超微结构仍存在病理改变。结论RSVG蛋白在RSV感染SD大鼠肾病病理模型造模成功后,大鼠肾、肺、脾组织中RSV G蛋白呈持续阳性表达,证明RSV呈持续感染状态。这一结果或提示,包括RSV在内的呼吸道病毒持续感染,是导致微小病变型肾病综合征(MCNS)患儿免疫功能紊乱的主要原因。
【作者单位】： 四川大学华西第二医院儿科;
【关键词】： 微小病变型肾病综合征 呼吸道合胞病毒感染 持续感染 荧光免疫测定 病理学模型 肾病 儿童
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81370807)~~
【分类号】：R725.1;R726.9;R-332
【正文快照】： 微小病变型肾病综合征(minimal　change实验过程对动物的处置符合动物伦理学要求。nephritic　syndrome,MCNS)因其在儿童中的高发1.2　方法病率和治疗手段有限,成为临床棘手疾病之一[1]。1.2.1　制作RSV组SD大鼠肾病病理模型与对照对于MCNS发病机制的研究,目前主要集中于对体

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