DYRK蛋白激酶调控TGF-β信号通路的功能与机制研究

发布时间：2017-09-18 04:08

  本文关键词：DYRK蛋白激酶调控TGF-β信号通路的功能与机制研究

  更多相关文章： 信号转导 TGF-β DYRKs E3泛素化复合物 磷酸化

【摘要】：转化生长因子-β (TGF-β)是一类多功能的细胞因子,能调控多种类型细胞的增殖、分化与凋亡,调节免疫系统和胚胎发育等过程,在多种疾病中发挥重要作用。以肿瘤为例,在其发展初期,TGF-β通过促进细胞的分化、凋亡等过程抑制肿瘤进展；后期肿瘤中,TGF-β则通过促进肿瘤细胞的上皮间充质转分化、诱导肿瘤血管生成和协助肿瘤细胞免疫逃逸等过程,导致肿瘤的恶化。TGF-β在肿瘤的发生发展过程中的作用相当关键,但对TGF-β信号是如何受到环境和遗传等因素的调控,目前仍旧所知甚少,值得进一步探索。通过对人全激酶的功能蛋白组学筛选,我们发现双特异性酪氨酸磷酸化调控激酶(DYRKs),依赖其丝苏氨酸激酶活性,通过介导Smad3的泛素化修饰,反向调控TGF-β/Smad信号通路。生化分析表明,DYRK蛋白激酶直接磷酸化Smad3 Linker区域的Thr179残基,导致Smad3通过与底物识别蛋白VPRBP结合,并在DDB1的作用下,招募EDD E3连接酶。VPRBP-DDB1-EDD (EDVP)复合物进而泛素化修饰Smad3,阻断Smad3与启动子及转录共激活子的结合,从而抑制TGF-p信号通路的活化。另外,敲减VPRBP、DDB1或用小分子抑制剂INDY抑制DYRK蛋白激酶的活性,将会促进TGF-β/Smad信号通路的活化。这些结果表明,DYRK蛋白激酶诱导的Smad3的磷酸化及后续EDVP E3复合物的招募对TGF-β/Smad信号有较为显著的影响。因此,我们的研究鉴定了TGF-β/Smad信号与功能的新的调控因子,也阐述了其调控的分子机制,这对于理解TGF-β这一关键细胞通路有较为重要的意义。
【关键词】：信号转导 TGF-β DYRKs E3泛素化复合物 磷酸化
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12
• 1 文献综述12-25
• 1.1 TGF-β信号通路及信号调控12-18
• 1.1.1 TGF-β超家族12-13
• 1.1.2 TGF-β信号通路13-15
• 1.1.3 TGF-β信号通路的功能15-16
• 1.1.4 TGF-β信号通路的调控16-18
• 1.2 蛋白激酶18-19
• 1.3 DYRK蛋白激酶19-22
• 1.3.1 DYRK蛋白激酶的结构19-21
• 1.3.2 DYRK蛋白激酶的功能21-22
• 1.4 泛素化修饰及功能调控22-23
• 1.5 EDVP复合物23-25
• 2 材料与方法25-44
• 2.1 材料25-29
• 2.1.1 细胞系与菌株25
• 2.1.2 主要的抗体25-26
• 2.1.3 主要试剂26-27
• 2.1.4 常规溶液配制27-29
• 2.2 实验仪器29-31
• 2.3 实验方法31-44
• 2.3.1 细胞培养31-32
• 2.3.2 细胞转染32-33
• 2.3.3 Western blot技术33-34
• 2.3.4 荧光素酶报告基因检测34
• 2.3.5 免疫共沉淀技术(Co-IP)34-35
• 2.3.6 体外激酶反应35-36
• 2.3.7 γ-S体外激酶反应36-37
• 2.3.8 siRNA技术37-38
• 2.3.9 DNA Pull-Down38-39
• 2.3.10 质粒构建39-41
• 2.3.11 大肠杆菌转化41
• 2.3.12 定点突变技术41-42
• 2.3.13 Real-Time PCR技术42-44
• 3 结果与分析44-69
• 3.1 DYRK蛋白激酶负调控TGF-β信号通路44-49
• 3.1.1 DYRK蛋白激酶比较显著地抑制TGF-β信号通路44-45
• 3.1.2 DYRK蛋白激酶抑制TGF-β信号通路依赖于它们的激酶活性45-47
• 3.1.3 敲低DYRK蛋白激酶将增强TGF-β信号通路47-49
• 3.2 DYRK蛋白激酶与Smad3相互作用形成复合体49-51
• 3.3 DYRK蛋白激酶直接磷酸化修饰Smad351-57
• 3.3.1 DYRK蛋白激酶在细胞内或体外磷酸化修饰Smad3的多个位点51-53
• 3.3.2 DYRK蛋白激酶磷酸化修饰Smad3的Thr132和Thr179残基53-55
• 3.3.3 DYRK蛋白激酶在细胞内和体外均促进Smad3的C端SXS位点的磷酸化55-57
• 3.4. DYRK蛋白激酶介导的修饰阻断Smad3与启动子结合57-61
• 3.4.1 DYRK蛋白激酶促进Smad3：Smad4复合物的形成57-59
• 3.4.2 核质分离实验表明DYRK2促进Smad3的入核59-60
• 3.4.3 DYRK2减弱Smad3与转录共激活子p300的结合60-61
• 3.4.4 DYRK2减弱Smad3结合DNA的能力61
• 3.5. DYRK蛋白激酶诱导Smad3招募EDVP复合物阻断其活性与功能61-69
• 3.5.1 VPRBP和DDB1与Smad3具有相互作用62-63
• 3.5.2 敲低EDVP复合体成分上调TGF-β信号通过增强Smad3的稳定性63-65
• 3.5.3 过表达EDVP复合体成员蛋白抑制TGF-β信号通路通过促进Smad3的降解65-67
• 3.5.4 EDVP复合物可能泛素化修饰Smad3的Lys333残基67-69
• 4 结论与讨论69-73
• 参考文献73-79
• 作者简介和科研成果79

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