c-Met阻断剂抑制产单核细胞李斯特菌胞内感染机制的研究

发布时间：2017-09-23 12:11

  本文关键词：c-Met阻断剂抑制产单核细胞李斯特菌胞内感染机制的研究

  更多相关文章： 产单核细胞李斯特菌 c-Met阻断剂 胞内感染 HBMEC Caco-2细胞 侵袭 细胞通透性

【摘要】：一、研究背景产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)简称单增李斯特菌,是李斯特菌属内唯一对人类致病的菌种。在临床治疗中,尽管抗生素已经有效地应用于各种感染性疾病的治疗,但是面对LM感染所导致的高致病率和高病死率,我们往往素手无策。LM对人体的感染多发生于免疫力低下的人群,如老年人、儿童、孕妇、长期服用免疫抑制剂的病人及患有免疫系统疾病的人群等等。LM的感染多由于消化道感染引起,摄入被LM污染的食物后,产单核细胞李斯特菌可粘附并侵袭肠道上皮细胞,其入侵肠道的重要毒力因子是产单核细胞李斯特菌表面的内化素B(Internalin B, InlB)。InlB可模拟肝生长因子或分散因子(Hepatocyte growth factor/Scatter factor)与存在于肠道上皮表面的肝生长因子受体或分散因子受体(Hepatocyte growth factor receptor/Scatter factor receptor/ c-mesenchymal-epithelial transition factor c-Met)结合, 以与天然配体HGF/SF/c-Met相同的方式,激发连续的信号级联放大,诱导c-Met β链上的酪氨酸残基转磷酸,包括c-Met的激活,Gabl、Cbl和Shc的募集和磷酸化,及包含有衔接子和PI3K亚单位的p85复合体形成,并侵入胞内造成进一步的感染。肠道上皮细胞无吞噬能力,LM进入肠道上皮细胞后可长期生存并于细胞内增殖。LM可引发细胞与细胞之间的感染,并可穿越肠道细胞进入血液,随血液循环到全身各组织器官后,引起多发性感染,其中最多见的李斯特菌病为脑膜炎、败血症、妊娠妇女流产、局灶性感染等等。脑膜炎是李斯特菌感染所引起的最严重的并发症,具有较高的致死率。由于血脑屏障最重要的组成部分为人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, BMECs),因此LM对于HBMEC的侵袭是李斯特菌脑病发生必备条件,其发生的关键步骤是存在于血液循环中的LM到达脑部并穿越血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)。总而言之,产单核细胞李斯特菌引起脑膜炎需要以下几个必要的条件：首先,免疫系统功能较低的人群摄入被LM污染的食物后,LM黏附和侵袭肠道上皮细胞,并在肠道上皮内长期生存和增殖；其次,LM侵袭肠道细胞后穿越肠道上皮细胞进入血压循环,发生严重的败血症并造成全身多器官和组织感染；最后,LM侵袭脑微血管内皮细胞,在胞内生长增殖并穿越血脑屏障,导致脑膜炎的发生。LM是一种胞内寄生菌,胞内菌又分为专性胞内菌和兼性胞内寄生菌。专性胞内菌仅寄居于活细胞内,而兼性胞内菌既可生存于活细胞内又可寄居于无生命的胞外环境。产单核细胞李斯特菌是一种兼性胞内菌,胞内和胞外皆可生存,对营养和温度的要求较低,通常在4-C条件下也可增殖,因此LM具有较强的生存能力,且导致食物中LM具有较高的污染率,人群中LM具有较高的感染率。目前抗生素广泛而有效地应用于各种感染性疾病的治疗,但是针对李斯特菌感染的治疗药物则仅仅为青霉素类、头孢菌素类、磺胺甲嗯唑等胞外抗生素,这些抗生素无法进入细胞内杀菌并且存在于细胞内的细菌可以逃避机体的免疫防御及清除等问题使得LM感染人体后导致较高的发病率和病死率。面对LM感染缺乏有效治疗药物的严峻挑战,我们围绕LM毒力因子内化素B(InlB)可模拟HGF/SF与其配体HGF/SF受体结合,从而导致细菌入侵无吞噬能力的上皮细胞并引起一系列信号通路的激活这一机制,提出利用c-Met受体阻断剂以阻断InlB与c-Met结合,研究c-Met受体阻断剂在抑制LM对宿主细胞的侵袭以预防和治疗LM感染的过程中扮演的角色。我们知道,格尔德霉素(Geldanamycin,GA)是一种经典的c-Met受体抑制剂,但是其水溶性较低,同时肝毒性和肾毒性较高等缺点导致目前在临床治疗中很少使用。然而,格尔德霉素类似物(Geldanamycin analogues,GAA)如替拉替尼(17-allylaminogeldanamycin,17-AAG)、17.二甲胺乙胺基.17.去甲氧基格尔德霉素(17-dimethy-laminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-DMAG)等,却比格尔德霉素具有更高的的水溶性、更低的肝毒性、肾毒性等,因此可作为一种潜在的阻断LM结合于细胞表面的c-Met受体抑制剂以进行研发。同时经查阅资料得知另一种新型c-Met受体阻断剂卡博替尼(cabozantinib, XL-184), XL-184于2012年获FDA批准上市用于临床疾病治疗。XL-184具有较长的药物半衰期,较GA更低的药物副作用,面对LM严重感染素手无策的困境,不失为一种较好的策略,因此XL.184也可作为一种潜在的预防和治疗LM感染的新型抗菌药物进行研发。因此,根据上述线索,本文主要从以下几个方面开展研究：(1)体外培养的人结肠腺癌细胞(Caco-2 cells)及HBMECs,从而研究17-AAG和XL-184在阻止LM侵袭Caco-2细胞和HBMEC中所起的作用；(2)将Caco-2细胞和HBMEC接种于Transwell小室,并测量17-AAG和XL.184孵育后单层细胞的跨膜电阻和渗透性,从而研究c-Met受体阻断剂卡在保护细胞屏障的完整性中所扮演的角色；(3)体外培养Caco-2细胞和HBMEC,并使用荧光染色技术(DAPI/PI)和乳酸脱氢酶(LDH)释放水平检测技术,从而研究在17-AAG和XL.184的介入下,LM所致细胞凋亡率的变化情况。二、研究方法1、检测LM浓度并绘制LM与OD值的相关曲线将LM培养至对数生长期,取100μl菌液于离心机中离心,转速10000 rpm,去上清。将细菌沉淀重悬于磷酸盐缓冲液(即PBS)中。菌液浓度稀释至1×10-1-10并于紫外分光光度计600 nm处测量OD值。将各浓度的菌液取100 ul涂布于无抗生素的BHI固体平板上,37℃孵箱孵育24 h,计数菌落数量,并分析菌落数量、菌液各稀释度与OD值之间的关系。2、c-Met受体阻断剂作用下LM生长曲线的测定配制体积为5 m1分别含XL.184浓度为0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10 μM的BHI液体培养基,同时于培养基中加入100μl处于对数生长期的LM,37℃、200 rpm摇床中孵育LM。分别于0、2、4、6、8、10、12、14和16 h取100μl菌液于96孔板中,酶标仪600 nm波长处测量吸光度值。以时间为横坐标,以A600处的吸光度值为纵坐标绘制LM生长曲线。3、研究LM对Caco-2和HBMEC的侵袭实验人结肠腺癌细胞Caco-2及HBMEC体外培养于24孔板,待细胞汇合成单层(约105/孔)后进行试验。实验方法为：细胞单层加入无抗生素的培养基和LM(约107/孔,使细胞感染倍数为100),37℃、5%C02培养箱培养90 min,无菌PBS洗三次,加入含庆大霉素100 μg/ml的培养基孵育细胞1 h,达到抑制胞外细菌的作用。再用无菌PBS洗三遍,取100 μl/孔0.5%Triton X-100于24孔板,孵育8 min后,立即加入50μl蒸馏水中止Triton X-100的裂解作用。裂解液梯度稀释(10’.104)后涂板培养,24 h后计数并计算LM侵袭率。4、c-Met受体阻断剂单独或与氨苄西林联合作用下LM对Caco-2和HBMEC的侵袭实验为了研究c-Met受体阻断剂17-AAG和XL-1 84在阻止LM侵袭Caco-2和HBMEC中所起的作用,首先体外培养Caco-2和HBMEC于24孔板,待细胞汇合成单层(约105/孔)并形成紧密连接后,于不同的时间、不同浓度的17-AAG和XL.184单独或与氨苄西林(Ampicillin, AMP)联合孵育Caco-2和HBMEC,孵育完毕后加入LM(约107/孔,使细胞感染倍数为100),洗单层细胞三次并加入含有庆大霉素100μg/ml的培养基孵育1h,再次洗单层细胞三次后用0.5%TritonX.100裂解细胞,裂解液梯度稀释(10-1-10-4)后涂板培养,24 h后计数并计算LM侵袭率。5、c-Met受体阻断剂作用下单层细胞通透性的检测Caco-2和HBMEC接种于Transwell小室上层,生长于聚碳酸酯膜的Caco-2或HBMEC,其细胞膜上的紧密连接结构形成一道相对紧密的屏障以阻止小分子物质通过细胞单层,并可将transwell分为上下室,Caco-2和HBMEC可分别视为模拟血.肠屏障和血.脑屏障。接种Caco-2和HBMEC的上层小室分别加入含不同浓度XL.184的MEM培养基和含不同浓度的17-AAG的1640培养基,孵育24 h,无菌PBS洗细胞三次,加入细菌(MOI=100)孵育1.5h,随后加入HRP 3μg于37℃孵育。分别于0、2、4、6 h从下层取30μl培养基涂布于不含抗生素的BHI固体平板,然后将培养基置于37-C细菌培养箱中24 h后观察并计数菌落数量。酶标仪于405 nm处测量检测下室MEM和1640培养基中HRP的浓度。电阻仪测量TEER值以观察单层细胞通透性的改变情况。从下室取出培养基用于检测后应加入同等体积的无菌培养基,使得下室培养基体积始终保持为2ml。6、c-Met受体阻断剂作用下细胞内LDH释放水平的检测含不同浓度XL.184的MEM培养基,不同浓度17-AAG的1640培养基分别孵育Caco-2和HBMEC 1、24 h,无菌PBS洗细胞三次,培养基中加入1×107LM(MOI=100),37*(2孵育1.5 h,取10 ul上清于96孑L板中,用于测量上清LDH浓度。然后加入0.5% TritonX-100裂解细胞,取10 ul细胞裂解液于96孔板,用于测量细胞内LDH含量。LDH含量测定步骤、方法、原理依据检测试剂盒说明书,于450 nm下检测吸光度。7、c-Met受体阻断剂作用下细胞存活率检测含有2.5、0.5、OμM XL-184和含有1000、250、0nM 17-AAG的培养基分别孵育Caco-2和HBMEC 24 h,无菌PBS洗三次,加入1×107 LM(MOI=100),37-C孵育细胞1.5 h,高压灭菌过的PBS清洗3遍,暗室内加入稀释的DAPI染液15 μl和稀释的PI染液15 μl,并置于暗室使其充分作用30 min,随后于OLYMPUS激光共聚焦荧光显微镜上机检测细胞的存活情况。8、统计学分析使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,统计学方法采用完全随机设计资料的方差分析及两因素方差分析,P0.05为差异有统计学意义,各实验至少重复三遍。三、结果1、c-Met阻断剂对体外LM生长曲线无影响在不同时间下,含不同浓度XL.184的BHI液体培养基中,LM的生长情况无差异。实验组与对照组相比,LM生长曲线形状相似,无统计学差异。2、致病菌LM对Caco-2细胞和HBMEC的侵袭率高于非致病菌DH5a、 BL21(DE3)对于Caco-2细胞：LM侵袭率约为0.168%,高于对照组DH5a的侵袭率0.019%(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵袭率0.023%(P=0.000)。对于HBMEC:LM侵袭率约为0.129%,高于对照组DH5a的侵袭率0.024%(P=0.000)、高于BL21(DE3)的侵袭率0.027%(P=0.000)。3、c-Met阻断剂可降低LM对于Caco-2细胞及HBMEC的侵袭率药物组侵袭率均低于对照组(P=0.000)。随XL-184浓度升高,LM对Caco-2、 HBMEC的侵袭率降低。相同剂量药物作用下,XL.184孵育Caco-2细胞1,2,6,12 h即可降低LM的侵袭率。XL-184孵育HBMEC 1,2,6h即可降低LM的侵袭率。随17-AAG浓度增高,LM对Caco-2的侵袭率有下降趋势。17-AAG孵育细胞1 h即可明显降低LM对Caco-2的侵袭。4、XL-184与AMP联合用药对于抑制LM侵袭Caco-2、HBMEC的效果优于XL-184单独用药各浓度XL.184分别与50 μg/ml AMP共孵育Caco-2细胞24 h；实验组LM对Caco-2的侵袭率低于对照组(P0～10.01,P50.05)；随XL-184剂量增大,LM对Caco-2的侵袭率有下降趋势。各浓度Amp分别与0.1 μM XL-184共孵育Caco-2细胞24 h；实验组LM对细胞的侵袭率均低于对照组(P0.01)；且随氨苄西林剂量增大,LM对Caco-2的侵袭率有下降趋势。各浓度XL.184分别与50 μg/ml氨苄西林共孵育HBMEC 24 h,实验组LM对细胞的侵袭率低于对照组(P=0.000)：随XL-184剂量增大,LM对HBMEC的侵袭率有下降趋势。各浓度Amp分别与0.1 μM XL-184共孵育细胞24 h,实验组LM对细胞的侵袭率均低于对照组(P=0.000)；随氨苄西林剂量增大,LM对HBMEC的侵袭率有下降趋势。5、17-AAG与氨苄西林联合用药对于抑制LM侵袭Caco-2的效果优于17-AAG单独用药各浓度17-AAG分别与50 μg/ml Amp共孵育细胞24 h,实验组LM对Caco-2的侵袭率低于对照组(P0=0.000,P50～1000.05,P250～5000.01)；随17-AAG剂量增大,LM对Caco-2的侵袭率有下降趋势。各浓度AMP分别与50 nM 17-AAG共孵育细胞24 h,实验组LM对Caco-2的侵袭率低于对照组(P0=0.000,P50.01,P25～500.05,P1000.05)；且随药物剂量增大,LM对Caco-2的侵袭率有下降趋势。6、XL-184可保护Caco-2细胞和HBMEC的通透性随XL-184孵育Caco-2浓度升高TEER值下降减缓(P0.05),下室培养基中HRP浓度降低,并且LM数量变少(P=0.000)。同时随LM侵袭Caco-2细胞时间的延长,TEER值降低幅度增大,下室HRP浓度升高,下室细菌数量增多。随XL-184孵育HBMEC浓度升高TEER值下降减弱(P0.05),下室培养基中HRP浓度降低,并且进入下室的LM数量变少(P0.01)。同时也可观察到随LM侵袭HBMEC时间的延长,TEER值降低幅度增大,下室HRP浓度升高,下室细菌数量增多。7、17-AAG可保护Caco-2细胞的通透性随17-AAG浓度升高TEER值下降减缓(P0.05),下室培养基中HRP浓度降低(P=0.000),并且LM数量变少(P0.05)。同时随LM侵袭Caco-2细胞时间的延长,TEER值降低幅度增大,下室HRP浓度升高,下室细菌数量增多。8、XL-184可降低Caco-2细胞和HBMEC的LDH释放水平提前孵育Caco-2细胞1、24 h,药物组LDH释放率均低于对照组,药物浓度越高LDH释放率下降趋势越明显(1 h.P10.05,P2.5～100.01),(24h：P0.1～100.01)。提前孵育HBMEC 1、24 h,药物组的LDH释放率低于对照组,药物浓度越高LDH释放率有下降趋势越明显(1h：P0.5～100.01),(24h：P05～10=0.000)。9、17-AAG可降低Caco-2细胞的LDH释放水平提前孵育1、24 h,药物组LDH释放率低于对照组,药物浓度越高LDH释放率下降趋势越明显(1h：P10000.001),(24 h：P250.10000.001)。10、XL-184可降低LM所致Caco-2细胞和HBMEC死亡率各浓度XL.184提前孵育Caco-2细胞,荧光染色结果：不同浓度组细胞存活率具有差异,两两比较,药物组细胞存活率大于对照组(P0.01)。各浓度XL-184提前孵育HBMEC,荧光染色结果：不同浓度组间细胞存活率具有差异,两两比较,药物组细胞存活率大于对照组(P0.01)。11、17-AAG可降低LM所致Caco-2细胞死亡率不同浓度17-AAG组细胞存活率具有差异,两两比较,药物组细胞存活率大于对照组(P=0.000)。结论1、c-Met阻断剂在体外不能抑制LM的生长2、c-Met阻断剂可降低LM对于细胞的侵袭3、c-Met阻断剂与青霉紊类抗生素联合应用可有效降低LM对于细胞的侵袭4、c-Met阻断剂通过降低LM对于细胞的侵袭进而抑制LM对细胞所产生的有害作用5、c-Met阻断剂通过降低LM介导的有害作用提高细胞的存活率
【关键词】：产单核细胞李斯特菌 c-Met阻断剂 胞内感染 HBMEC Caco-2细胞 侵袭 细胞通透性
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-26
• 前言26-30
• 第一章 c-Met阻断剂在抑制产单核细胞李斯特菌侵袭体外肠道屏障模型中的作用30-51
• 1.1 材料30-33
• 1.1.1 菌株及细胞30
• 1.1.2 主要试剂30
• 1.1.3 主要仪器30-31
• 1.1.4 主要培养基和常用试剂的配制31-33
• 1.2 方法33-37
• 1.2.1 产单核细胞李斯特菌的培养与保存33
• 1.2.2 产单核细胞李斯特菌浓度的测量33-34
• 1.2.3 Caco-2细胞的复苏、传代与冻存34
• 1.2.4 XL-184作用下LM生长曲线的测量34-35
• 1.2.5 致病菌LM与非致病菌DH5a、BL21(DE3)对Caco-2细胞的侵袭实验35
• 1.2.6 c-Met作用下LM对于Caco-2细胞的侵袭实验35-36
• 1.2.7 c-Met阻断剂作用下单层Caco-2细胞通透性检测36
• 1.2.8 c-Met阻断剂作用下Caco-2细胞内LDH释放水平检测36
• 1.2.9 c-Met阻断剂作用下LM介导的Caco-2细胞毒力作用分析36-37
• 1.3 统计学分析37
• 1.4 结果37-49
• 1.4.1 XL-184在体外对于LM的生长曲线无影响37-38
• 1.4.2 致病菌LM对Caco-2细胞的侵袭率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)38
• 1.4.3 XL-184可降低LM对于Caco-2细胞的侵袭率38-39
• 1.4.4 XL-184与氨苄西林联合用药降低LM侵袭Caco-2细胞的效果优于XL-184单独用药39-40
• 1.4.5 XL-184可保护Caco-2单层细胞的通透性40-42
• 1.4.6 XL-184可降低LM介导的Caco-2细胞LDH释放水平42
• 1.4.7 XL-184可降低LM所致Caco-2细胞死亡率42-43
• 1.4.8 17-AAG可降低LM对于Caco-2细胞的侵袭率43-44
• 1.4.9 17-AAG与氨苄西林联合用药降低LM侵袭Caco-2细胞的效果优于17-AAG单独用药44-45
• 1.4.10 17-AAG可保护Caco-2单层细胞的通透性45-47
• 1.4.11 17-AAG可降低LM介导的Caco-2细胞LDH释放水平47-48
• 1.4.12 17-AAG可降低LM所致Caco-2细胞死亡率48-49
• 1.5 讨论49-51
• 第二章 XL-184阻断剂在抑制产单核细胞李斯特菌侵袭体外血脑屏障模型中的作用51-66
• 2.1 材料52-55
• 2.1.1 菌株及细胞52
• 2.1.2 主要试剂52
• 2.1.3 主要仪器52-53
• 2.1.4 主要培养基和常用试剂的配制53-55
• 2.2 方法55-57
• 2.2.1 产单核细胞李斯特菌的培养与保存55
• 2.2.2 HBMEC的复苏、传代与冻存55-56
• 2.2.3 致病菌LM与非致病菌DH5a、BL21(DE3)对HBMEC的侵袭实验56
• 2.2.4 XL-184作用下LM对于HBMEC的侵袭实验56
• 2.2.5 XL-184作用下单层HBMEC单层细胞通透性检测56-57
• 2.2.6 XL-184作用下HBMEC细胞内LDH释放水平检测57
• 2.2.7 XL-184作用下LM介导的HBMEC毒力作用分析57
• 2.3 统计学分析57-58
• 2.4 结果58-63
• 2.4.1 致病菌LM对HBMEC的侵袭率高于非致病菌DH5a、BL21(DE3)58
• 2.4.2 XL-184可降低LM对于HBMEC的侵袭率58-59
• 2.4.3 XL-184与氨苄西林联合用药降低LM侵袭HBMEC的效果优于XL-184单独用药59-60
• 2.4.4 XL-184可保护Caco-2单层细胞的通透性60-62
• 2.4.5 XL-184可降低LM介导的HBMEC细胞LDH释放水平62
• 2.4.6 XL-184可降低LM所致HBMEC细胞死亡率62-63
• 2.5 讨论63-66
• 全文总结66-69
• 参考文献69-73
• 中英文缩略词表73-74
• 攻读硕士期间发表论文74-75
• 致谢75-77

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本文编号：905178