活细胞微丝骨架和spectrin连接蛋白结构张力的识别及其调控机制分析

发布时间：2017-09-30 00:17

  本文关键词：活细胞微丝骨架和spectrin连接蛋白结构张力的识别及其调控机制分析

  更多相关文章： cpstFRET actin spectrin talin 瘢痕抑制因子 轴突再生 药物

【摘要】：目的：力学信号是与化学、电信号同样重要的活细胞调控因素。基于荧光共振能量转移(FRET)原理,我们构建了荧光蛋白cpstFRET模块,嵌入actin和spectrin结构蛋白中,将骨架结构张力转换为光学信号,旨在揭示胞内张力在维持细胞生命活动和调控神经元极化和轴突生长再生所发挥的作用。方法：基于FRET原理和分子克隆技术,改造Cerulean和Venus荧光蛋白并构建成cpstFRET模块,分别插入两个β-actin基因之间和单分子spectrin基因内构建成AcpA和spectrinM张力探针。将两个张力探针分别转入细胞内,并整合到微丝和spectrin蛋白内。当Actin束或spectrin蛋白结构张力发生改变,能导致FRET供受体间的角度从平行转向垂直,FRET效率降低,结构张力变化转变为可见的光学信号。采用激光共聚焦FRAP/FLIP技术、3D扫描模块以及低渗(ddH2O)、IP3受体激动剂(Caffeine)刺激等手段验证探针有效性。AcpA探针在PC12细胞系中表达后,结合pEGFP-C 1-talin、pcDNA3.1 (+)-E-cadherin质粒,β-NGF、胶质瘢痕抑制因子等药物建立神经元轴突生长或再生抑制的体外微丝张力检测模型,用于检测talin和E-cadherin在轴突生长中的作用。最后,在MCF-7细胞系中表达两种探针,检测药物维拉帕米、长春碱、喜树碱和紫杉醇分别对actin束和spectrin蛋白结构张力的影响,阐明不同药物诱导下骨架结构蛋白的力学效应。结果：基于FRET原理构建的基因编码荧光张力检测探针AcpA和SpectrinM可实时测定活细胞内结构张力变化。低渗和caffeine刺激均能使actin和spectrin蛋白结构张力增强。神经元细胞中,神经生长因子(NGF)可上调神经细胞胞内结构张力,而瘢痕抑制因子aggrecan和CSPG能减弱胞内结构力强度；在NGF刺激的PC12细胞内,神经元轴突内张力显著高于胞体；此外,talin能上调胞内微丝张力,正向调控轴突生长；瘢痕抑制因子和E-cadherin下调胞内微丝张力,负向调控轴突再生。Talin也可以部分逆转瘢痕抑制因子对轴突再生的抑制。钙通道阻滞剂维拉帕米可以提高细胞内actin和spectrin蛋白结构张力；喜树碱诱导下,actin束和spectrin蛋白张力均显著增强；微管蛋白特异性药物长春碱和紫杉醇诱导微丝蛋白张力显著增强,而spectrin蛋白张力小幅增长后又逐渐恢复正常水平。结论：胞内张力信号参与多种细胞生理活动调节,如神经元极化、轴突再生、细胞凋亡和形态稳定等。Talin过表达能上调神经元胞内微丝张力,而微丝张力增强对神经元分化和轴突延伸有促进作用。细胞可通过Ca2+依赖的方式上调微丝骨架和spectrin蛋白张力,但Ca2+浓度降低不一定会导致actin和spectrin蛋白张力的降低。微管功能抑制后,微丝骨架张力可能部分弥补微管功能缺失,维持细胞正常生理。本研究揭示了微丝张力和spectrin蛋白牵拉力对细胞形态和生理活动的调控机制,为探明细胞内结构张力活动提供新的检测工具和有效的研究方法。
【关键词】：cpstFRET actin spectrin talin 瘢痕抑制因子 轴突再生 药物
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-40
• 1. 实验材料与试剂15-18
• 1.1 仪器设备15-16
• 1.2 试剂来源16-18
• 2. 研究方法18-40
• 2.1 细胞培养18
• 2.2 咖啡因及其他药物配制18-19
• 2.3 cDNA克隆和探针构建19-21
• 2.3.1. 探针构建原理19-20
• 2.3.2. 探针质粒的构建20
• 2.3.3. 定量和半定量评估20-21
• 2.4 质粒转化、扩增和提取21-25
• 2.4.1. 质粒转化与扩增21-23
• 2.4.2. 质粒提取23-25
• 2.4.3. 质粒浓度测量25
• 2.5 质粒转染及共转染25-26
• 2.5.1. 质粒转染25-26
• 2.5.2. 质粒共转染26
• 2.6 蛋白质提取和浓度测量26-27
• 2.6.1. 总蛋白的提取26-27
• 2.6.2. 蛋白含量的测量——BCA法27
• 2.7 免疫荧光27-28
• 2.8 总RNA提取28-30
• 2.8.1. 总RNA提取28-29
• 2.8.2. RNA浓度测量29
• 2.8.3. 琼脂糖凝胶电泳29-30
• 2.9 PCR30-33
• 2.9.1 逆转录30-31
• 2.9.2. PCR扩增目的序列31-32
• 2.9.3. 目的片段纯化32-33
• 2.10 酶切和连接33-34
• 2.10.1. 双酶切33
• 2.10.2. 连接33-34
• 2.11 激光共聚焦34-39
• 2.11.1. FRET SE34-36
• 2.11.2. FRET AB36-37
• 2.11.3. FRAP37-39
• 2.12 数据处理39-40
• 结果40-47
• 第一部分 荧光张力探针设计及有效性检测40-42
• 1、cpstFRET模块和actin、spectrin荧光张力检测探针构建40
• 2、FRAP和FLIP验证探针有效性和准确性40-41
• 3、actinM和spectrinM探针的3D成像41
• 4、低渗条件下渗透压对actin蛋白的影响41-42
• 5、钙信号对微丝张力及Spectrin牵拉力的作用42
• 第二部分 微丝张力调控神经元极化、轴突生长和再生机制42-44
• 1、NGF通过talin上调胞内微丝结构张力,促进神经元极化和轴突生长42-43
• 2、胶质瘢痕抑制因子和E-cadherin部分下调微丝张力,抑制轴突生长和再生43-44
• 3、Talin/vinculin和瘢痕抑制因子调控神经元胞内张力机制44
• 第三部分 抗肿瘤药物对actin和spectrin蛋白机械应力的作用研究44-47
• 1、维拉帕米44-45
• 2、长春碱45
• 3、喜树碱45-46
• 4、紫杉醇46-47
• 讨论47-51
• 小结51-52
• 参考文献52-57
• 实验结果及中文注释57-66
• 附录(一) 综述66-88
• 参考文献83-88
• 附录(二) 缩略词表88-90
• 附录(三) 发表文章90
• 附录(四) 获得的荣誉90-91
• 附录(五) 致谢91

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本文编号：945059