沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬与凋亡的影响

发布时间：2017-10-04 21:24

  本文关键词：沙眼衣原体pORF5质粒蛋白对HeLa细胞自噬与凋亡的影响

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【摘要】：目的：自噬和凋亡是决定细胞命运的重要因素,参与各种疾病的病理和生理过程。尽管随着研究的不断深入对自噬与凋亡的调控机制已经取得了重要进展,但关于沙眼衣原体引起的自噬和凋亡的具体调控机制尚未清楚。本研究试图探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对HeLa细胞自噬和凋亡的影响,为进一步阐明沙眼衣原体的致病机制提供实验依据。方法：将pDSRed C1/pORF5重组菌接种在LB固体培养基上,37℃恒温培养箱中培养12-16h,挑取单个菌落,转种于LB液体培养基中,37℃恒温振荡培养4h；按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书提取pDSRed C1/pORF5重组质粒；用含NheI、EcoRI酶切位点的pORF5特异性引物扩增pORF5基因,再分别双酶切PCR扩增产物和慢病毒表达载体DCE(PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP);酶切产物纯化后进行连接,并转化感受态细胞DH5a,然后进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定；高纯度无内毒素抽提慢病毒表达重组质粒后,与辅助质粒共转染293T细胞,转染后8h更换培养基,继续培养48h,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,上清浓缩后得到高滴度的慢病毒颗粒,采用倍比稀释法检测病毒滴度；慢病毒感染HeLa细胞,荧光显微镜下观察感染情况；流式分选获得稳定转染细胞株DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa;间接免疫荧光方法和Western blot方法鉴定稳定转染细胞株中pORF5的表达；血清饥饿处理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa细胞24h,qRT-PCR、Western blot和间接免疫荧光检测LC3(mi crotubule-associated proteinl light chain3)、Becinl的表达水平；TNF-α处理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率；DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均用血清饥饿和3-MA分别处理,RT-PCR检测细胞Bax和Caspase-3的表达情况。结果：1、成功建立DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa稳转细胞株,经过流式分选稳转株纯度达95%以上。2、间接免疫荧光结果显示,饥饿处理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均出现LC3红色荧光斑点,定量后分别为(34.0±2.6个/细胞)和(97.6±12.1个/细胞),且DCE-pORF5-HeLa较DCE-HeLa点状荧光斑点明显增多(P0.05)。3、血清饥饿处理的DCE-HeLa细胞中LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclinl蛋白表达水平比未处理组分别增加了56.0%(P0.01)和57.8%(P0.01)；血清饥饿组处理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclin1的蛋白表达水平比未处理组分别增加了87.2%(P0.01)和76.6%(P0.01)；饥饿处理的DCE-pORF5-HeLa中 LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclinl的表达水平比同处理的DCE-HeLa分别升高了53.3%(P0.01)和28.7%(P0.05)。4、饥饿处理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的mRNA表达水平较同处理的DCE-HeLa分别降低47.6%和25.7%(P0.05),3-MA处理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的表达mRNA水平较同处理的DCE-HeLa分别低73.0%和43.6%(P0.05)5、未处理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa细胞的凋亡率均低于5%,而TNF-a处理后6h后,DCE-pORF5-HeLa的凋亡率达为(44.4±6.0)%,对照组DCE-HeLa细胞凋亡率为(62.9±0.8)%,DCE-pORF5-HeLa凋亡率比DCE-HeLa细胞降低了29.4%(P0.05)结论：1、pORF5质粒蛋白可诱导HeLa细胞自噬。2, pORF5质粒蛋白可抑制HeLa细胞凋亡,机制与其诱导的自噬有关。
【关键词】：沙眼衣原体 质粒蛋白pORF5 自噬 细胞凋亡
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R374.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-15
• 第二章 实验材料15-19
• 2.1 主要实验仪器15
• 2.2 载体、菌株及细胞株15-19
• 第三章 实验方法19-39
• 3.1 pDSRed C1/pORF5真核表达重组质粒的提取与鉴定19-21
• 3.2 重组慢病毒的制备21-27
• 3.3 DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa稳转细胞株的建立27-31
• 3.4 pORF5质粒蛋白与HeLa细胞自噬的关系31-35
• 3.5 pORF5对HeLa细胞凋亡的影响35-36
• 3.6 pORF5诱导的自噬对HeLa细胞凋亡的影响36-37
• 3.7 统计学分析37-39
• 第四章 实验结果39-55
• 4.1 pDSRed C1/pORF5真核表达载体的鉴定39
• 4.2 pORF5慢病毒表达载体的鉴定39-42
• 4.3 pORF5基因慢病毒的包装和纯化42-44
• 4.4 pORF5基因慢病毒感染HeLa细胞44-46
• 4.5 DCE-pORF5-HeLa细胞中pORF5质粒蛋白表达的鉴定46-47
• 4.6 饥饿对细胞自噬相关基因的表达的影响47-51
• 4.7 Real-Time PCR检测细胞饥饿处理与3-MA处理后的凋亡情况51-52
• 4.8 pORF5对HeLa细胞凋亡的影响52-55
• 第五章 讨论55-61
• 第六章 结论61-63
• 参考文献63-67
• 综述67-77
• 参考文献72-77
• 本研究受以下基金资助77-79
• 作者攻读学位期间的科研成果79-81
• 致谢81

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本文编号：972931