光化学法联合凝血酶注射构建大鼠颅内静脉窦血栓形成模型的实验研究

发布时间：2017-10-06 05:13

  本文关键词：光化学法联合凝血酶注射构建大鼠颅内静脉窦血栓形成模型的实验研究

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【摘要】：研究背景：颅内静脉窦血栓形成(Cerebral venous sinus thrombosis, CVST)是一组由多种病因所导致罕见的脑静脉系统疾病,其临床症状复杂多变,且严重危害到人类的生命。由于皮层静脉及静脉窦主干形成血栓,能够继发性引起脑水肿、缺血性脑损伤、脑出血、颅内高压、昏迷、神经功能缺陷甚至死亡。成年人每年发病率为4-5/10万人,儿童每年的发病率为7/100万人。并且,CVST的发病率在逐年增高,约占脑血管意外疾病1%。其发病原因有口服避孕药、妊娠、产褥期等,约75%的患者为成年女性。近年来,随着诊断技能、神经影像技术、治疗技术的发展,超过80%的病人都得到了良好的预后。近年来,CVST动物模型被用于血脑屏障破坏、脑水肿形成等病理生理变化研究及药物治疗效果评估。然而,目前所建立的CVST动物模型的手段及病理生理研究结果有较大的差异性,一个稳定的CVST动物模型需具备以下特性：1、能够模拟人类CVST的病理生理变化特点；2、CVST的阶段性变化与人类保持一致；3、提供一个可供评估治疗效果的测试平台。然而,迄今为止仍然缺少能够完全满足上述特点的动物模型方案。目前国内的研究通过以下几种方式来构建CVST动物模型：1、上矢状窦单纯结扎或阻塞法；2、结扎上矢状窦后注射促凝物质；3、单纯凝血酶注射4、血管介入球囊阻塞下注射凝血酶；5、氯化铁(FeCl3)溶液湿敷。已有研究证实,血栓所累及的皮层静脉及桥静脉越多,其脑损伤程度越大。皮层静脉及桥静脉堵塞后,血流无法通过侧支循环进行代偿,可引起静脉缺血性脑梗死。然而,上述动物模型构建方法都无法在避免永久结扎静脉窦的情况下,使得静脉窦及皮层静脉同时形成血栓。光敏剂在脑血管循环时,在激发光照射下,可产生光化学反应,从而释放氧自由基,氧自由基是一种有害的代谢物质,能够造成生物膜系统损伤及细胞内氧化磷酸化障碍。一方面,氧自由基可与血管内皮细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应。脂质过氧化物增加可破坏PGI2与TXB2的平衡,促进血小板聚集粘附,激活凝血过程。另一方面,自由基也可损伤内皮细胞,使血管壁的内皮细胞的细胞膜脱落,暴露出内皮下层的基底膜,内皮下层富含氨基葡聚糖与胶原物质,能够促进血小板的粘附与聚集。内皮细胞受损后白细胞向血管内皮细胞粘附,加重损伤,形成恶性循环,最终在血管中形成血栓。光化学法的血栓形成过程与人类脑血栓形成发病机制、血栓形成过程、损害程度较为相近,加之光照或光敏剂对血管本身不存在机械性损害,与临床上的血栓性疾病的病理、生理上的发病机制极为相似。光化学法形成的血栓富含红细胞、血小板及纤维蛋白,类似于临床上静脉红色血栓的病理结构。该方法可造成血小板聚集及血管内皮细胞损伤,为抗血小板聚集药和抗血栓药物及预防血栓药物的研究提供可能性,因而可广泛用于CVST等脑血管病的基础与临床研究。本课题旨在现有CVST动物模型的研究基础上,在通过光化学法联合凝血酶注射的方式构建一个可用于基础、临床试验研究的大鼠上矢状窦.皮层静脉血栓模型,从而提供一个有利于深入CVST疾病研究及治疗效果评估的平台。颅内静脉窦血栓形成是一种罕见的、多病因的静脉缺血性脑卒中,发病率仅占所有中风的0.5%,然而血栓形成于静脉的不同位置、皮层静脉及桥静脉的受累与否使得临床症状出现多样性,缺乏特征性,早期的影像学特征不明显又给诊断添加了不少难度,容易漏诊甚至误诊。近年来,随着诊断技术及治疗手段的发展,CVST的诊断率提高,大多数患者能够得到早期治疗,预后良好,死亡率大大下降。然而CVST的发病机理及生理病理学研究尚未透彻,有待进一步深入探索。CVST的病理生理改变是个复杂的过程,其动态改变在判断疾病预后发展过程中显得尤为重要,目前国内外少有相关报道。在本研究中,我们通过光化学法联合凝血酶注射形成稳定、可重复的CVST动物模型并通过观察血脑屏障通透性、脑水肿、脑损伤和神经功能状态在较长的时间内的动态改变,探索CVST不同发展阶段的病理生理学特点,为于临床治疗提供理论基础并对疾病的发展作出预后判断。第一部分光化学法联合凝血酶注射构建大鼠CVST模型研究目的：构建一种新型CVST动物模型,检测血栓形成的位置及范围,为评估模型稳定性、可重复性及探索大鼠CVST模型的病理生理动态改变奠定基础。研究方法：将Wistar成年大鼠麻醉后,放置在保暖毯,维持体温约37摄氏度,进行静脉置管。置管完毕后将大鼠摆置呈俯卧位,脑立体定向固定。头部正中切皮2cm,双氧水腐蚀筋膜及肌肉暴露骨面,于前囟及人字缝之间设计骨窗,在外科显微镜观察下,边用高速颅骨钻钻开骨窗,边用生理盐水冷却。扩大骨窗,保留硬脑膜,暴露上矢状窦、皮层静脉及部分脑皮层。开启全固态半导体激光器,固定光源位置,并确定激光照射位置,将孟加拉玫瑰红溶液以1mg/kg/min的速度经尾静脉缓慢注射,即用波长532nm、功率密度15 mw/mm2、直径1mm光斑的激光束照射距后囟0.5mm的上矢状窦尾端处及距前囟0.5mm的上矢状窦头端处,各持续10min,观察到照射处血管形成棕黑色血凝块。随后穿刺上矢状窦头端,缓慢注射凝血酶,持续10min后拔出穿刺针。使用血管荧光造影法检测血栓形成范围。研究结果：凝血酶注射15min后,在模型组中,通过外科显微镜可观察到上矢状窦及皮层静脉血液凝结成暗红色血凝块。荧光体视显微镜下观察到无造影剂残留的上矢状窦、桥静脉及皮层静脉呈黑色显影,而对照组无明显的血栓形成及黑色显影。研究结论：通过光化学法产生的自由基可损伤内皮细胞,使血管壁的内皮细胞的细胞膜脱落,暴露出内皮下层的基底膜,内皮下层富含氨基葡聚糖与胶原物质,能够促进血小板的粘附与聚集,激活凝血过程,诱导上矢状窦头尾两端血栓形成。通过凝血酶注射,使凝血酶扩散至桥静脉及皮层静脉中,使血管中的血液凝结。通过外科显微镜镜下观察及血管荧光造影法证实了血栓在上矢状窦、桥静脉及皮层静脉中形成,从而建立起大鼠上矢状窦-皮层静脉模型。第二部分探索大鼠CVST模型的病理生理动态改变研究目的：建立大鼠上矢状窦-皮层静脉模型,检测其血脑屏障完整性、脑含水量、神经功能、脑梗死体积、梗死部位的血管及神经胶质细胞的动态变化情况。研究方法：将143只Wistar成年大鼠随机分为模型组,假手术组,控制对照组,在不同分组中根据研究的时间点分为第1天、第2天、第7天3个亚组。根据不同分组进行处理,在不同的时间点对大鼠麻醉,并灌注固定,取大鼠上矢状窦、硬脑膜及大脑组织,应用依文思蓝荧光染色在荧光显微镜下观察大脑皮层的血脑屏障完整性改变情况；通过干湿重法测定脑的含水量,了解脑水肿程度变化；转杆实验检测大鼠的神经功能改变；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫组化测定脑梗死的体积及范围；免疫组化法检测梗死部位的血管生成情况及神经胶质细胞的数量改变。研究结果：实验结果显示,与假手术组及控制对照组相对比,实验组大鼠大脑皮层处血脑屏障及神经功能在术后第1天时受损,且在第2天时损伤程度加重,同时伴随着脑水肿,然而在第7天时,血脑屏障完整性、脑含水量及神经功能逐渐恢复正常；TTC染色、HE染色及MAP-2免疫组化显示大鼠在术后第1天出现脑梗死,在第2天时脑梗死体积达到最大,同时可见脑缺血坏死、出血、脑水肿等病理改变,随后在第7天时梗死体积逐渐缩小；免疫组化结果显示微血管数量在术后第1天、第2天保持恒定,而星形胶质细胞的数量在第1天、第2天时显著减少,但在第7天时,微血管及星形胶质细胞数量明显多于正常组及模型组。研究结论：证实了通过光化学法联合凝血酶注射构建的大鼠CVST模型能够模拟人体CVST的病理生理改变,通过探索大鼠CVST模型不同疾病发展阶段的病理生理改变,为临床治疗提供了干预契机,从而减少致残率及死亡。
【关键词】：颅内静脉窦血栓形成 动物模型 血脑屏障 脑水肿 光化学反应
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743;R-332
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-26
• 参考文献23-26
• 第一部分 光化学法联合凝血酶注射构建大鼠CVST模型26-39
• 一、引言26-27
• 二、实验材料和方法27-32
• 三、结果32-33
• 四、讨论33-36
• 小结36
• 参考文献36-39
• 第二部分 探索大鼠CVST模型的病理生理动态改变39-64
• 一、引言39-40
• 二、实验材料和方法40-50
• 三、结果50-56
• 四、讨论56-60
• 小结60
• 参考文献60-64
• 全文总结64-66
• 中英文缩略词66-68
• 攻读硕士学位期间发表的论文68-69
• 致谢69-71

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本文编号：980900